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1. Preparación de la línea celular
- Descongeló aproximadamente 1.000.000 de células de la médula espinal del neuroblastoma de ratón (células NSC-34) que se almacenaron en un contenedor de nitrógeno líquido. Utilice una incubadora de agua a 37 °C hasta que las células estén completamente descongeladas.
- Agregue un medio fresco y tibio (medio DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina y 1% de antibióticos pen-estreptococos).
- Centrifugar las células descongeladas (SL16R) a 500 x g durante 5 min, formando un pellet de celda. Deseche el medio y agregue 1 mL de medio nuevo para la resuspensión celular.
- Coloque las células resuspendidas en un matraz de 15 mL y agregue 5 mL adicionales de medio. Incubar las células durante la noche en una incubadora estéril con 5% de CO2 a 37 °C.
- Paralelamente, coloque 8 cubreobjetos sin recubrimiento (cubreobjetos: 12 mm, 0,13-0,17 mm de grosor) en una placa de cultivo de 60 mm y esterilice con etanol al 70% y exponga a 30 minutos de luz ultravioleta hasta que se seque. Agregue medio a cada plato y deséchelo para lavar el etanol residual.
- Agregue tampón de tripsina (2,5 g de tripsina y 0,2 g de EDTA en 1 L de la solución salina equilibrada de Hanks) a las células después de que alcancen aproximadamente el 90% de confluencia (aproximadamente 6 millones de células por matraz) para permitir que las células adherentes se disocien< />
NOTA: Las células NSC-34 son sensibles y solo requieren 15 s de incubación con tampón de tripsina y 1 minuto adicional de incubación libre de tripsina antes de la disociación con el medio.
- Coloque las células en las placas de cultivo de 60 mm que ya contienen los cubreobjetos con 3 mL de medio, aproximadamente 350.000 por placa. Déjelos en la incubadora durante 24 horas para permitir la fijación de las células a los cubreobjetos.
2. Validación de la expresión de proteínas
- Coloque en hielo placas de cultivo de 60 mm que contengan las células residuales (no utilizadas en el experimento anterior) de cada grupo experimental.
- Deseche el medio y lave las células dos veces con PBS para diluir y lavar el medio restante.
- Trate las células con 200-400 μL de tampón de lisis que contiene PBS, Triton al 0,5% y tableta de cóctel inhibidor de proteasa (PI). Raspe con un raspador de celdas.
- Recoja las células en tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga y homogeneice con un homogeneizador a 4.000 rpm durante 1 min bajo hielo.
- Centrifugar las células homogeneizadas a 2.500 x g durante 10 min. Recoger el sobrenadante, cuantificar la concentración de proteína mediante un ensayo de Bradford y almacenar a -20 °C hasta su uso.
- Recoja entre 30 y 70 μg de proteína total (dependiendo de la proteína) y cárguela en un gel SDS-PAGE para analizar la expresión de proteínas mediante un ensayo de inmunotransferencia.