1. Determinación de la expresión relativa de proteínas de la superficie celular en astrocitos por biotinilación
NOTA: Aquí, ilustramos la aplicación de esta técnica de biotinilación al estudio de los efectos de la molécula de matriz extracelular laminina en la localización de la superficie celular del canal permeable al agua acuaporina-4 (AQP4). Los materiales especializados necesarios para este ensayo incluyen sulfo-NHS-LC-biotina (sulfosuccinimidil 6-(biotinamido) hexanoato) y resina de estreptavidina-agarosa (ver Tabla de materiales).
- Utilizando este método, se preparan los cultivos de astrocitos corticales aproximadamente 2 semanas antes del ensayo y se cultivan en matraces de 75 cm2 con ventilación. Cuando los astrocitos tengan una confluentez del 80 al 90%, sepárelos de la superficie de cultivo con tripsina al 0,05% y luego páselos 1:3.
- A las 48 h antes del ensayo, cuando las células vuelven a tener una confluencia del 80 al 90 %, los astrocitos pasan 1:3 (teniendo en cuenta el cambio en el formato de cultivo) a placas de cultivo celular de 60 mm para que tengan una confluencia del >70 % el día en que se va a realizar el experimento. Asegúrese de que las células se distribuyan uniformemente entre los platos.
- 16 h antes del ensayo, pipetear laminina en medio de cultivo hasta una concentración final de 24 nM e incubar a 37 °C.
- Inmediatamente antes del ensayo, prepare lo siguiente y luego colóquelo en hielo o refrigere: CM-PBS (100 mg/L de MgCl2∙6H2O y 100 mg/L de CaCl2 en solución salina tamponada con fosfato 1X [PBS], pH 7,4), tampón de biotina (0,5 mg/mL de sulfo-NHS-LC-biotina en CM-PBS), tampón de enfriamiento (50 mM NH4Cl en CM-PBS), tampón de lisis (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM de glicina, 150 mM de NaCl y 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético [EDTA], 1% de tritón X-100, 1X cóctel de inhibidores de la proteasa), tampón de carga 3X (150 mM de Tris, pH 6,8, 6% de dodecil sulfato de sodio [SDS], 30% de glicerol, 300 mM de ditiotreitol [DTT] y 0,01% de azul de bromofenol) y tampón de lavado (10 mM de Tris (pH 7,4), 1,5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1% Triton X-100, cóctel de inhibidores de la proteasa 1X).
- Retire las placas que contienen los cultivos de astrocitos de la incubadora y deseche el medio.
- Lave las celdas tres veces con 4 ml de CM-PBS frío y coloque los platos sobre hielo picado.
- Pipetee 2 ml de tampón de biotina en cada pocillo e incline suavemente los platos hacia adelante y hacia atrás varias veces para garantizar una cobertura completa. Dejar en hielo durante 30 min.
- Retire el tampón de biotina con un aspirador y reemplácelo con un tampón de enfriamiento de 4 mL. Dejar en hielo durante 10 min.
- Aspire el tampón de enfriamiento y reemplácelo con un volumen equivalente del mismo. De nuevo, dejar en hielo durante 10 min.
- Deseche el tampón de enfriamiento y lave las celdas tres veces con 4 ml de CM-PBS refrigerado.
- Raspe las células en CM-PBS refrigerado de 1 mL con un elevador de células y transfiera la suspensión al tubo de microcentrífuga.
- Células de pellets por centrifugación a 100 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón de lisis.
- Deje las muestras en hielo durante 30 minutos, en vórtice cada 5 minutos, o colóquelas en un rotador de extremo a extremo a 4 °C.
- Centrifugar el lisado a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C para granular cualquier material insoluble en detergente. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
- Guarde 50 μL de este lisado y añádale tampón de carga. A continuación, desnaturalizarlo calentándolo a 95 °C en un baño seco; Esta es la fracción de "entrada", que contiene tanto proteínas biotiniladas de la superficie celular como proteínas citosólicas no biotiniladas.
- Amplíe la abertura de la punta de una pipeta cortando aproximadamente 0,5 cm de material desde su extremo con unas tijeras afiladas. Con esta punta de pipeta, transfiera 75 μL de perlas de estreptavidina-agarosa (normalmente almacenadas a 4 °C) al lisado e incube a 4 °C durante 3 h en un agitador/balancín.
- Dado que la estreptavidina-agarosa se vende con frecuencia como una suspensión que contiene un 50% de perlas por volumen, suspendidas en una solución antimicrobiana, triture la suspensión para asegurarse de que las perlas se suspendan uniformemente y, a continuación, pipetee 150 μL de la suspensión en cada muestra.
- Perlas de estreptavidina-agarosa en gránulos por centrifugación a 1500 x g durante 30 s a 4 °C.
- Ahorre 50 μL del sobrenadante (añadir tampón de carga y desnaturalizarlo a 95 °C en un baño de agua o bloque calefactor); representa la fracción "intracelular" y está compuesta principalmente por proteínas citosólicas no biotiniladas.
- Vuelva a suspender las perlas peletizadas en 1 ml de tampón de lavado y muévalo durante 3 min a 4 °C. Perlas de gránulos (como en el paso 1.16) y deseche el sobrenadante. Repita este proceso 4 veces para minimizar la unión inespecífica de proteínas citosólicas no biotiniladas.
- Granular las perlas por centrifugación (1500 x g durante 30 s a 4 °C) y desechar el tampón de lavado superpuesto. Añadir 50 μL de tampón de carga 1X (diluido con tampón de lisis). Libera biotina y estreptavidina de las perlas desnaturalizándolas a 95 °C; Esta fracción debe contener únicamente proteínas biotiniladas de la superficie celular (fracción de "superficie celular").
- Separe las fracciones de entrada, de superficie celular e intracelulares mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida) y analice mediante Western blot.
nota: Si bien utilizamos un gel de gradiente prefabricado del 4 al 20% en nuestros experimentos, un gel separador del 12 al 14% con una capa de apilamiento del 4% (cada una contiene un 0,1% de SDS) debería ser suficiente para las proteínas de interés en este estudio. También se debe utilizar un estándar de peso molecular del rango de tamaño apropiado. Tenga en cuenta que a veces puede haber un cambio ascendente observable en las masas moleculares aparentes de las proteínas biotiniladas.