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Evaluación de la internalización de proteínas de superficie diana utilizando un derivado de la biotina

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuente: Tham, D. K. L., et al., Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos primarios de astrocitos mediante biotinilación. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra un método para evaluar la internalización de proteínas diana en los astrocitos corticales de ratón utilizando biotinilación, seguida de lisis celular, extracción de proteínas basada en estreptavidina, desnaturalización y análisis de Western blot para confirmar la internalización exitosa.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Determinación de la tasa de internalización de proteínas de la superficie celular en astrocitos por biotinilación

>NOTA: A continuación, describimos un experimento típico de biotinilación de persecución de pulsos utilizado en este caso para rastrear la endocitosis de AQP4 en astrocitos. Los materiales especializados necesarios incluyen sulfo-NHS-SS-biotina, resina de estreptavidina-agarosa, glutatión reducido y yodoacetamida (consulte

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
No se han declarado conflictos de interés.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA9647-50
Azul de bromofenolBio-Rad#1610404
Cóctel completo de inhibidores de proteasasSigma-Aldrich11697498001
Etilendiaminatetraacetato disódico dihidratado (EDTA)Bio-Rad#1610729
Ditiotreitol (TDT)Bio-Rad#1610611
Medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM)Gibco/Thermo Fisher Scientific11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-BiotinaThermo Fisher Scientific#21331
Suero fetal bovinoGibco/Thermo Fisher Scientific16000-044
glicerolFisher CientíficoBP229-1
glicinaSigma-AldrichG8898
YodoacetamidaBio-Rad#163-2109
L-glutaminaGibco/Thermo Fisher Scientific25030-081
Penicilina/estreptomicinaGibco/Thermo Fisher ScientificNúmeros 15140-122
Peroxidasa AffiniCabra Pura Anti-Conejo IgG (H+L)Laboratorios de Investigación Inmunológica Jackson111-035-045
Tampón de fosfato salinoGibco/Thermo Fisher Scientific10010-023
Glutatión reducidoSigma-AldrichG6529
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher CientíficoS271-500
Dodecil sulfato de sodio (SDS)Sigma-Aldrich862010
Hidróxido de sodio (NaOH)Fisher CientíficoS318-100
Resina de estreptavidina y agarosaThermo Fisher Scientific#20347
Anticuerpo policlonal anti-AQP4 de conejoAlomoneAQP-004
Base Tris (base Trizma)Fisher CientíficoBP152-1
Tris-HClFisher CientíficoBP153-1
Tritón X-100Fisher CientíficoBP151-500

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Protein InternalizationBiotinylation AssayCell Surface ProteinsStreptavidin PurificationWestern Blot AnalysisAstrocyte CulturesCleavable BiotinReducing Agent TreatmentStreptavidin AgaroseGel Electrophoresis

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