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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Determinación de la tasa de internalización de proteínas de la superficie celular en astrocitos por biotinilación
>NOTA: A continuación, describimos un experimento típico de biotinilación de persecución de pulsos utilizado en este caso para rastrear la endocitosis de AQP4 en astrocitos. Los materiales especializados necesarios incluyen sulfo-NHS-SS-biotina, resina de estreptavidina-agarosa, glutatión reducido y yodoacetamida (consulte la tabla de materiales).
- Prepare cultivos de astrocitos corticales de ratón en placas de 60 mm utilizando los métodos descritos en la sección anterior. Asegúrese de que las células tengan aproximadamente un 70 % de confluentes el día del ensayo y de que cada placa contenga un número equivalente de células.
- Inmediatamente antes del ensayo, prepare lo siguiente y colóquelo en hielo o refrigere: CM-PBS o solución salina tamponada con fosfato (100 mg/L de MgCl2∙6H2O y 100 mg/L de CaCl2 en 1X PBS, pH 7,4), tampón de biotina (0,5 mg/mL de sulfo-NHS-SS-biotina en CM-PBS), tampón reductor (50 mM de glutatión reducido, 75 mM de NaCl y 75 mM de NaOH), tampón de enfriamiento (50 mM de yodoacetamida, 1% BSA, en CM-PBS), tampón de lisis (25 mM de Tris, pH 7,4, 25 mM de glicina, 150 mM de NaCl y 5 mM de EDTA o ácido etilendiaminotetraacético, 1% de tritón X-100, cóctel de inhibidores de la proteasa 1X), tampón de carga 3X (150 mM de Tris, pH 6,8, 6% de SDS o dodecil sulfato de sodio, 30% de glicerol, 300 mM de DTT o ditiotritol y 0,01% de azul de bromofenol), y tampón de lavado (10 mM de Tris, pH 7,4, 1,5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de tritón X-100, cóctel de inhibidores de proteasa 1X).
- Prepare un medio de cultivo celular fresco (medio Eagle modificado de Dulbecco; o DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de L-glutamina) y colóquelo en un baño de agua a 37 °C.
- Retire los cultivos de astrocitos de la incubadora y aspire el medio con un aspirador.
- Lave las celdas tres veces con 4 ml de CM-PBS frío y coloque los platos sobre hielo picado.
- Pipetee 3 ml de tampón de biotina en cada plato, incline los platos hacia adelante y hacia atrás varias veces para asegurarse de que el tampón esté bien distribuido y déjelo en hielo durante 30 minutos.
- Aspire el tampón de biotina y reemplácelo con 5 ml de medio tibio. Incubar una placa de cultivo a 37 °C durante 15 min, y una segunda placa a la misma temperatura durante 30 min. Deje otro plato a 4 °C como muestra de 0 min.
- Al final del período de incubación, deseche el medio y lave las células tres veces con 4 ml de CM-PBS refrigerado. Pipetear 6 mL de tampón reductor sobre las células y dejarlas en hielo durante 15 min.
- Retire el tampón reductor y reemplácelo con 6 ml de tampón reductor nuevo. Coloque la mezcla en hielo durante 15 minutos más.
- Retire la solución reductora y reemplácela con un tampón de enfriamiento de 6 mL. Dejar actuar en hielo durante 15 min.
- Repita el paso de enfriamiento una vez más.
- Deseche el tampón de enfriamiento y lave las celdas tres veces con 4 mL de PBS refrigerado.
- Con un elevador de células, raspe las células en 1 ml de PBS refrigerado y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga.
- Células de pellets por centrifugación a 100 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en tampón de lisis de 500 μL.
- Déjelo en hielo durante 30 minutos y en vórtice cada 5 minutos. Alternativamente, coloque las muestras en un rotador de extremo a extremo a 4 °C durante este tiempo.
- Centrifugar el lisado a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C para granular los materiales insolubles en detergente, luego transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Guarde 50 μL de este lisado, agréguele tampón de carga y desnaturalice a 95 °C en un baño seco; Esta es la fracción de "entrada", que contiene tanto proteínas endocitosas biotiniladas como proteínas no biotiniladas.
- Con una punta de pipeta cortada, añadir 150 μL de la suspensión de estreptavidina-agarosa al lisado e incubar a 4 °C durante 3 h en un agitador/balancín.
- Perlas de estreptavidina-agarosa en gránulos por centrifugación a 1.500 x g durante 30 s a 4 °C.
- Vuelva a suspender las perlas en un tampón de lavado de 1 ml y cocine durante 3 min a 4 °C. Perlas de pellets (según el paso 1.18) y deseche el sobrenadante. Repita este proceso 4 veces para minimizar la unión inespecífica de proteínas citosólicas no biotiniladas.
- Perlas de pellets por centrifugación a 1.500 x g durante 30 s a 4 °C y desechar el tampón de lavado suprayacente. Añadir 50 μL de tampón de carga 1X (diluido con tampón de lisis). Libera biotina y estreptavidina de las perlas desnaturalizando a 95 °C; Esta fracción debe contener únicamente proteínas internalizadas de la superficie celular (fracción "endocitosada").
- Separar las fracciones de entrada, de superficie celular y no unidas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y analizadas por Western blot.
nota: Si bien utilizamos un gel de gradiente prefabricado del 4 al 20% en nuestros experimentos, un gel separador del 12 al 14% con una capa de apilamiento del 4% (cada una contiene un 0,1% de SDS) debería ser suficiente para las proteínas de interés en este estudio. También se debe utilizar un estándar de peso molecular del rango de tamaño apropiado. Tenga en cuenta que a veces puede haber un cambio ascendente observable en las masas moleculares aparentes de las proteínas biotiniladas.