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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de Matrices
- Hervir 4-8 matrices de silicona en un microondas o en una placa caliente durante 5 min y dejar que se sequen completamente durante 1 h bajo flujo laminar (lado rayado hacia arriba).
nota: Los siguientes procedimientos deben realizarse bajo flujo laminar.
- Sople aire comprimido o use cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo del lado rayado de las matrices. Mantenga limpio el lado rayado para que pueda adherirse firmemente a la superficie de la placa.
- Coloque con cuidado las matrices en platos de plástico de 6 cm presionando con un dedo (una matriz por plato; con la raya hacia abajo). Evite que se formen burbujas de aire entre la matriz y el plato. Marque la ubicación de las rayas en la parte inferior de la placa de cultivo.
- Si la matriz no se adhiere, repita desde el paso 1.2.
>2. Generación de rayas y recubrimiento de laminina para el cultivo de neuronas
- Prepare proteína recombinante marcada con fluorescencia (25 μl para inyección [paso 2.2] o 100 μl para cada uno para el método de colocación [paso 2.2.1]) mezclando la proteína marcada con Fc (10-50 μg/ml) y un anticuerpo Fc antihumano conjugado con colorante fluorescente (proporción de 1 a 3: 30-150 μg/ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego, incuba la mezcla durante 30 min en RT.
- Con una jeringa de 22 G, inyecte 25 μl de la proteína recombinante preparada en el paso anterior (2.1) a través del pequeño orificio en el costado de la matriz (flechas en las figuras 1A, 1C y 1E).
- Alternativamente, coloque 100 μl de la proteína recombinante en la ranura superior de la matriz y aspire aproximadamente la mitad de la solución desde el orificio pequeño (flechas en las figuras 1A, 1C y 1E), de modo que la proteína recombinante permanezca en las regiones rayadas.
- Incubar la placa durante 30 min a 37 °C en una incubadora de cultivos celulares.
- Coloque 300 μl de PBS en la ranura superior (Figura 1B) y aspire desde el pequeño orificio ubicado en el costado de la matriz (flechas en las Figuras 1A, C y E) para eliminar las proteínas recombinantes no unidas. No aspire el PBS por completo, porque las proteínas se secarán. Repita este paso dos veces. (3 veces en total)
- Retire con cuidado la matriz e inmediatamente coloque ~100 μl de proteína de control (10-50 μg/ml; Fc) para cubrir toda el área rayada, creando un recubrimiento alternativo. A continuación, incubar la placa durante 30 min a 37 °C en la incubadora de cultivos celulares.
- Después de lavar la superficie del plato tres veces con PBS, cúbrala con ~ 100 μl de laminina de 20 μg / ml en PBS.
nota: La laminina debe descongelarse en hielo para evitar la solidificación.
- Incubar la placa durante 1 h a 37 °C en la incubadora de cultivos celulares.
- Lave la superficie del plato tres veces con PBS y agregue medio de cultivo. Coloque la placa recubierta con medio de cultivo en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C hasta su uso.
>3. Cultivo de neuronas del hipocampo a partir de embriones de ratón E15.5
- Aplicar la eutanasia a la madre a través de la luxación cervical y aislar tres embriones E15.5.
- Corta la piel y el cráneo sagitalmente en la línea media de la cabeza con unas tijeras y retira el cerebro con una cuchara pequeña. Transfiera el cerebro con cuidado a una placa de Petri de 60 mm que contenga 3 ml de Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS).
- Con un bisturí, corte los hemisferios, incluidos la corteza, el hipocampo y el cuerpo estriado (Figura 2A). A continuación, diseccione la región del hipocampo retirando cuidadosamente las meninges y transfiera los tejidos del hipocampo disecados a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 2 ml de solución de HBSS, en hielo (Figura 2B-C). Recoge 6 hipocampos de 3 embriones en el tubo, que son suficientes para cultivar neuronas en 8 platos.
- Sustituir la solución de HBSS por una solución de tripsina/etilendiamina (tripsina/EDTA) (2 ml) e incubar el tubo a 37 °C durante 15 min en un baño de agua.
nota: Aspire HBSS sin centrifugación y no decante la solución de HBSS inclinando el tubo.
- Neutralizar la actividad de la tripsina añadiendo 500 μl de suero fetal bovino (FBS).
- Centrifugar la mezcla a 100 x g durante 5 min. Retirar el sobrenadante y lavar el pellet con 2 ml de medio de cultivo. Repita este paso una vez más.
- Pipetear el hipocampo hacia arriba y hacia abajo 10 veces en un medio de cultivo utilizando una punta de 1.000 μl con un orificio grande (punta cortada) para disociar el tejido.
- Cambie a una punta regular (sin cortar) de 1.000 μl y pipete el tejido disociado hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión unicelular.
- Separe las células individuales pasándolas a través de un filtro de células de malla de 80-100 μm.
- Centrifugar la suspensión monocelular filtrada a 150 x g durante 5 min.
- Extraer el sobrenadante por aspiración, y resuspender el pellet (neuronas) en 2 ml de medio de cultivo.
- Cuente las células con un hemocitómetro con tinción con azul de tripán para determinar la densidad y la viabilidad. A continuación, coloque 10.000 neuronas en 150 μl de medio de cultivo para cada conjunto de rayas. La suspensión debe colocarse con cuidado para cubrir toda la región de la raya.
