Entrega de una lesión cerebral traumática al cerebro de un ratón

Resumen

Fuente: Zhong, J., et al. Imágenes intravitales de la expresión de proteínas fluorescentes en ratones con una lesión cerebral traumática de cráneo cerrado y ventana craneal utilizando un microscopio de dos fotones. J. Vis. Exp. (2023)

Este video muestra la entrega de Lesión Cerebral Traumática (TBI) en ratones. Después de exponer el cráneo, se marca el sitio del traumatismo craneoencefálico. A continuación, el ratón se coloca debajo del dispositivo TBI. El impacto se produce levantando la varilla de metal y permitiendo que caiga libremente sobre el impactador, que está en contacto con el cráneo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Administración de una inducción de lesión cerebral traumática repetitiva (TCE)

NOTA: Los parámetros del TBI se han ajustado a partir de informes anteriores, en los que el impacto del TBI se entregó una vez. El protocolo aquí aplica el mismo parámetro, excepto que aumenta el número de impacto total a 10.

1. Equipo de TBI
   1. Utilice un dispositivo portátil hecho a medida para administrar un traumatismo craneoencefálico cerrado (Figura 1A) en la cabeza del ratón del lado derecho, como se indica en la Figura 1B.
2. Preparación antes de la cirugía
   1. Equipo quirúrgico de autoclave, que incluye tijeras regulares, un calibrador quirúrgico, tijeras quirúrgicas de resorte, pinzas quirúrgicas, pinzas para mosquitos, piezas para postes de cabeza, gasas y aplicadores con punta de algodón.
   2. Pesar y registrar el peso corporal del ratón 2 h antes de la cirugía. Para minimizar el edema cerebral durante la implantación de la ventana craneal, inyecte fosfato de dexametasona sódico a una dosis de 4,8 mg/kg [2 mg/mL, generalmente ~70 μl (es necesario inyectar en dos sitios)] en el músculo cuádriceps utilizando una jeringa de insulina. Después de la inyección de dexametasona, pero antes de comenzar la cirugía de LCT, prepare las ventanas de vidrio como se indica en el paso 2.1 para su uso posterior.
   3. Desinfectar la etapa quirúrgica y el equipo de TBI con etanol al 75%. Amplíe el paño quirúrgico estéril desechable para cubrir la etapa de la cirugía en la plataforma estereotáxica. Encienda el aparato de calefacción y el monitor de temperatura, ajustando la temperatura objetivo a 37 °C.
   4. Abra la válvula del tanque de oxígeno y ajuste el flujo de oxígeno a 1,5 L/min. Abra la máquina de anestesia y ajuste el valor del nivel de isoflurano a tres.
      NOTA: El oxígeno 100% puro puede ayudar al animal a sobrevivir a los impactos de la LCT.
   5. Coloque el ratón en la cámara de inducción y déjelo reposar durante 5 minutos para lograr una anestesia completa.
   6. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (es decir, con una frecuencia respiratoria lenta pero constante de aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de la cola), retire el ratón de la cámara de inducción y coloque la cabeza del ratón en el marco estereotáxico.
   7. Coloque el cono de la nariz del tubo de anestesia sobre el hocico del ratón.
   8. Mantener la anestesia utilizando isoflurano al 1,5% mezclado con oxígeno puro al 100% a un caudal de 1 L/min hasta el final de la cirugía. Revise periódicamente la frecuencia de la respiración y aplíquele un pellizco en la cola o en los dedos de los pies al menos cada 15 minutos durante la cirugía para evaluar la anestesia adecuada. Ajuste la concentración de isoflurano según corresponda para mantener la profundidad deseada de la anestesia.
3. Cirugía de LCT
   1. Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por vía subcutánea) utilizando jeringas de insulina desechables y aplicar pomada oftálmica en los ojos del ratón.
   2. Retire el vello de la parte superior de la cabeza recortándolo con unas tijeras 1 y luego aplicando un agente depilatorio durante 1 min.
      PRECAUCIÓN: No aplique el producto depilatorio durante más de 3 minutos en el cuero cabelludo, ya que es un irritante de la piel. Además, evite que cualquier agente depilatorio entre en contacto con los ojos del ratón.
   3. Limpie la piel del cuero cabelludo aplicando gasas y aplicadores con punta de algodón. Luego, desinfecte la piel, usando primero etanol al 75% y luego betadín. Repita esto tres veces (es decir, etanol seguido de betadine), dejando la aplicación final de betadine en la piel.
   4. Vuelva a comprobar la profundidad del anestésico para asegurarse de que el ratón está completamente anestesiado (es decir, frecuencias respiratorias lentas pero constantes a aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola). Cubra la piel con pinzas quirúrgicas 3 y haga una incisión en la línea media de 12-15 mm de largo comenzando aproximadamente 3 mm después de los ojos.
   5. Extirpa la piel sobre el hemisferio izquierdo y derecho del cráneo con unas tijeras de resorte 2.
   6. Una vez que el cráneo esté expuesto, retire el periostio frotándolo suavemente con un aplicador estéril con punta de algodón y enjuagándolo con solución salina estéril.
   7. Inspeccione visualmente el estado del cráneo para asegurarse de que esté intacto, a excepción de los dos pequeños orificios, que se hicieron para la cirugía anterior de inyección de virus.
   8. Seque el área del cráneo y marque el sitio de impacto del TCE en las siguientes coordenadas: 2,5 mm posterior al Bregma y 2 mm lateral desde la sutura sagital hacia la derecha (Figura 1B).
   9. Retire rápidamente el mouse del marco estereotáxico y coloque la cabeza en el cojín amortiguador debajo del dispositivo TBI.
   10. Alinee la punta del impactador con el sitio de impacto marcado.
   11. Levante la columna de metal tirando de la cuerda de nailon atada 15 cm por encima de la cabeza del ratón y luego suéltela, permitiendo que el peso caiga libremente sobre la varilla del transductor, que está en contacto con la parte superior del cráneo en el sitio del TBI. No toque la cabeza del ratón cuando administre el impacto de TBI.
   12. Mueva el ratón sobre la manta térmica y colóquela boca arriba mientras controla el estado de la respiración.
   13. Una vez que el ratón pase de una posición supina a una posición prona, colóquelo en la cámara de inducción de isoflurano durante ~ 5 minutos con un 3% de isoflurano mezclado con oxígeno puro al 100% a un caudal de 1,5 L / min.
   14. Una vez que el ratón esté completamente sedado (es decir, con una frecuencia respiratoria lenta pero constante de aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola), repita los pasos 1.3.9-1.3.14 para lograr un total de 10 impactos.
       NOTA: En nuestro estudio, se han encontrado diez impactos de LCT que inducen un fenotipo robusto con baja mortalidad en ratones (datos aún no publicados). Los parámetros se pueden ajustar para lograr una gravedad diferente de la lesión cerebral aumentando o disminuyendo el número de impactos y/o la altura desde la cual se libera el peso. Todos los parámetros están sujetos a la aprobación de la IACUC local.
   15. Revise el cráneo bajo un microscopio quirúrgico y retire el ratón del estudio si se ha producido una fractura de cráneo.
   16. Para la cirugía simulada, siga los mismos procedimientos que se describieron anteriormente, incluida la colocación del animal debajo del impactador pero sin administrar los impactos de TBI.
   17. Después de que el ratón pase de una posición supina a una posición prona después del 10º impacto de TBI, colóquelo en la cámara de inducción de isoflurano durante ~ 5 min. A continuación, siga los pasos 1.2.6-1.2.8 para colocar la cabeza del ratón en el marco estereotáxico para la cirugía de implantación de ventana craneal que se describe a continuación.

Resultados

Figura 1: Diagramas para el dispositivo TBI, el sitio del impacto TBI y la preparación de la ventana. (A) Equipo para el dispositivo TBI de caída de peso. 1: pedestal, 2: soporte, 3: abrazadera ajustable, 4: cuerda de nylon, 5: túnel de caída de peso, 6: columna de peso metálica (50 g), 7: impactador, 8: cojín amortiguador. (B) Un esquema del sitio de la inyección del virus y del impacto del TCE, con...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinceles aplicadores de precisión ajustables	Parkell	S379
Jeringa de insulina BD	Bd	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16" x 31G
Betadine	Purdue	NDC67618-151-17	Incluye 7,5% de povidona yodada
Buprenorfina	PAR Farmacéutica	NDC 42023-179-05
Ethonal	Fisher Científico	04355223EA	75%
Aparatos de calefacción	CWE	Ratón TC-1000	Equipado con el instrumento estereotáxico y ser utilizado mientras se opera la cirugía
Manta calefactora	Farmacia CVS	E12107	Dispositivo de calentamiento adicional y que se utilizará después de la cirugía
Pomada oftálmica lubricante	Picetal	NDC 46066-753-55
rotulador	Delasco	SMP-BK
Pinzas para mosquitos	Carolina	Articulo #:625314	Acero inoxidable, curvo, 5 in
Agente depilatorio	Corporación McKesson	N/A	Nair Loción Depilatoria de Aloe y Lanolina
Tijera normal 1	Eurostat	Eurostat ES5-300
Tijera normal 2	Instrumentos de precisión mundial	N° 501759-G
salino	Biomundo	L19102411PR
Tijera de resorte 1	Instrumentos de precisión mundial	N° 91500-09	Punta recta
Tijera de resorte 2	Instrumentos de precisión mundial	Nº 91501-09	Punta recta
Plataforma estereotáxica	KOPF	Modelo 900LS
Pinzas quirúrgicas 1	CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA	Registro# 0508-5/45-PO	Estilo 5/45, curvo
Pinza quirúrgica 2	CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA	catlog# 0103-5-PO	Estilo 5, recto
Pinzas quirúrgicas 3	CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA	catlog# 72912
Pinza quirúrgica 4	CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA	Registro# 0508-5/45-PO	Estilo 5/45, curvo
Lámpara quirúrgica	Leica	Leica KL300 LED
Adhesivo para tejidos Vetbond	3M Cuidado de los animales	Número de pieza:014006