Inmunotinción de fluorescencia de neuronas del hipocampo de rata dentro de un chip microfluídico

Resumen

Fuente: Nagendran, T., et al., Uso de chips microfluídicos de plástico preensamblados para compartimentar neuronas murinas primarias. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra la tinción de inmunofluorescencia de neuronas de hipocampo de rata cultivadas dentro de un chip microfluídico para analizar la maduración neuronal y la conectividad.

Protocolo

1. Inmunotinción de fluorescencia dentro del chip

1. Prepare una solución de fijación de formaldehído al 4% en PBS (formaldehído al 4%, 1 μM MgCl₂, 0,1 μm CaCl₂, 120 mM de sacarosa)
2. Retire la mayoría de los medios en los pocillos de la viruta (no seque los compartimentos interiores).
3. Añadir inmediatamente 100 μL de solución de fijación a los pocillos superiores de los compartimentos axonal y somático.
4. Después de 1 min, agregue 100 μL de solución de fijación a los pocillos inferiores. Fijar durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Retire la mayor parte de la solución de los pocillos de la viruta (no seque los compartimentos interiores). Añadir inmediatamente 150 μL de PBS a cada uno de los pocillos superiores de los compartimentos axonal y somático. Espere 2 minutos para que el PBS fluya hacia los pozos inferiores.
6. Repita el paso 1.5 dos veces.
7. Retire la mayor parte del PBS de los pocillos del chip. Añadir inmediatamente 150 μL de PBS con TritonX-100 al 0,25% en cada uno de los pocillos superiores de los compartimentos axonal y somático. Espere 15 min.
8. Retire la mayor parte del líquido de los pocillos del chip e inmediatamente agregue 150 μL de solución bloqueante (10% de suero de cabra normal en PBS) a cada uno de los pocillos superiores de los compartimentos axonal y somático. Espere 15 min.
   nota: Las soluciones bloqueantes efectivas deben ser específicas para el anticuerpo secundario, por ejemplo, para un anticuerpo secundario anti-ovejas de burro, use suero de burro en la solución de bloqueo.
9. Retire la mayor parte del líquido de los pocillos del chip e inmediatamente agregue 100 μL de anticuerpo primario (o anticuerpos) en suero de cabra normal al 1% en PBS a cada uno de los pocillos superiores de los compartimentos axonal y somático. Cubra para minimizar la evaporación y espere 1 h a temperatura ambiente o 4 °C durante la noche.
10. Retire la mayor parte de la solución de los pocillos de la viruta (no seque los compartimentos interiores). Añadir inmediatamente 150 μL de PBS a cada uno de los pocillos superiores de los compartimentos axonal y somático. Espere 5 minutos para que el PBS fluya hacia los pozos inferiores.
11. Repita el paso 1.10 dos veces.
12. Retire la mayor parte del líquido de los pocillos del chip e inmediatamente agregue 100 μL de anticuerpo secundario (o anticuerpos) en PBS a cada uno de los pocillos superiores de los compartimentos axonal y somático. Cubra para minimizar la evaporación y espere 1 h a temperatura ambiente.
    nota: Consulte las instrucciones del fabricante para conocer la dilución recomendada de los anticuerpos secundarios.
13. Repita los pasos 1.10-1.11.
14. Si se toman las imágenes dentro de 1 día después de la inmunotinción, mantenga el chip lleno de PBS. Si el chip se va a almacenar más de 1 día antes de la toma de imágenes, envuelva el plato que contiene el chip en una película de parafina para evitar la evaporación y guárdelo a 4 °C hasta que esté listo para la obtención de imágenes.
15. Para el almacenamiento a largo plazo de muestras, se pueden utilizar medios de montaje (p. ej., Fluoromount-G).
    1. Retire la mayor parte del líquido de los pocillos de la viruta. Utilice una pipeta de plástico desechable de 1 ml para añadir 2 gotas de medio de montaje a cada uno de los pocillos superiores de los compartimentos axonal y somático.
    2. Incline el chip para fomentar el flujo de los medios de montaje a través de los canales. Después de 5 minutos, agregue 2 gotas a los pocillos inferiores. Espere 1 h antes de que imaging.
       nota: Después de usar el medio de montaje, no será posible volver a sondear para otros objetivos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC150	Barrera de microranura de 150 μm de longitud
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC450	Barrera de microranura de 450 μm de longitud
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC900	Barrera de microranura de 900 μm de longitud
Precapa XC	Xona Microfluidics, LLC	Pre-Capa XC	incluido con XonaChips
XonaPDL	Xona Microfluidics, LLC	XonaPDL
Medio neurobasal	ThermoFisher Scientific	21103049
Pipetas Pasteur de vidrio	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA
Perfora 16% de formaldehído	ThermoFisher Scientific	28906
PBS (10x)	ThermoFisher Scientific	QVC0508
Suero de cabra normal	ThermoFisher Scientific	16210064
Tritón X-100	ThermoFisher Scientific	28314
Anticuerpo anti-vGlut1	NeuroMab	75-066	clon N28/9, 1:100
Anticuerpos secundarios Alexa Fluor	ThermoFisher Scientific		17:40
Sistema de imagen confocal de disco giratorio	Tecnología Andor	CSU-X1, iXon X3 EMCCD	60 veces aceite de silicona y 20 veces con objetivos