1. Marcaje fluorescente e inmunocitoquímica
>Nota: El marcaje inmunofluorescente de cultivos de células corticales primarias se llevó a cabo en placas de cultivo celular de 35 mm con fondo de vidrio con un volumen de trabajo de 1 ml.
- Lave el plato con fondo de vidrio dos veces con solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 (PBS).
- Fije las celdas con paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
- Lavar las celdas dos veces con PBS y permeabilizar con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 5 min.
- Tratar las células durante 20 min en RT con una tinción específica de actina F (filamentosa), AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 μl de Phalloidin en 1 ml de PBS).
- Enjuague las células dos veces con PBS y bloquee con suero de cabra normal al 10% en RT durante 1-2 horas.
- Diluir el anticuerpo policlonal de pollo anti-MAP2 (proteína 2 asociada a microtúbulos) (1:2.500) en PBS con un 2% de suero de cabra normal e incubar O/N (durante la noche) a 4 0C.
- Después de la incubación, enjuague en PBS dos veces.
- Diluir el anticuerpo secundario (Alexa Red 594-conjugado goatat anti-chicken IgG (1:500) con un 2% de suero de cabra normal e incubar durante 2 h en RT.
- Enjuague con PBS y agregue 10 μl/plato de tinte Hoescht.
- Incubar durante 3 min en RT y lavar con PBS dos veces.
nota: Las celdas marcadas ahora están listas para el paso 2 (conteo de puntos de F-actina).
- Conserve la muestra de célula con 100 μl de reactivo antidecoloración como agente de deslizamiento y manténgala a 4 0C en la oscuridad para su almacenamiento a largo plazo.
nota: La faloidina es relativamente estable en PBS a +4 °C en la oscuridad durante un máximo de 1 semana, y la fluorescencia se puede preservar con reactivos antidecoloración. Sin embargo, las imágenes óptimas se obtienen de 1 a 3 días después de la tinción, ya que la faloidina puede comenzar a difundirse con un almacenamiento prolongado.
>2. Conteo de Puncta de F-actina
- Encienda el microscopio fluorescente y cambie a 20× objetivo. Abra el software del microscopio y configure el programa con un tamaño de imagen de 1280×960 píxeles y una resolución de imagen de 0,17 μm/píxel con un zoom de 1×.
- Adquiera imágenes de neuronas F-actina/MAP2 comarcadas bajo canales fluorescentes verdes (495 nm) o rojos (613 nm).
- Elija 5 imágenes fluorescentes verdes (F-actina)/rojas (MAP2)/azules (Hoescht) de neuronas individuales con árboles dendríticos claramente definidos.
- Identificar las estructuras ricas en F-actina en el segmento dendrítico de segundo orden (rango de longitud 25-75 μm) con inmunofluorescencia MAP2 continua.
- Gire la región seleccionada de las imágenes a un nivel horizontal. Copiar y pegar como una nueva imagen.
- Reste el fondo de las imágenes, utilizando un ajuste coherente para cada plato.
- Cuente los puntos de F-actina de color verde brillante y trace la longitud del segmento dendrítico seleccionado manualmente por observadores independientes entrenados. Exporte los datos a un archivo de hoja de cálculo.
- Calcule la densidad dividiendo el total de puntos marcados con F-actina (N) por la longitud (L) de las dendritas marcadas con MAP2. Exprese los datos como el número de puntos de F-actina por 10 μm de dendrita
nota: Se incluyeron puntos (tamaño ≤1,5 μm) de fluorescencia de F-actina con una intensidad máxima de al menos un 50% por encima de la intensidad media de la tinción en el eje dendrítico en cada segmento dendrítico seleccionado.
