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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Animales
- Utilice ratas macho y hembra de 3 meses de edad en este estudio.
- Mantenga a los animales en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con libre acceso a comida y agua.
>2. Preparación de cóctel KAX (ketamina + xilacina + acepromazina) para anestesia animal
- Disolver 50 mg de xilacina (20 mg/ml) en 5 ml de ketamina (100 mg/ml) con 1 ml de acepromazina (10 mg/ml) y 3 ml de agua destilada. Homogeneizar.
- Esterilice con un filtro de jeringa y almacene esta solución en un frasco de suero de 10 ml.
>3. Inyección KAX
- Pesar al animal (g) y devolverlo a la jaula hasta que esté listo para la inyección.
- Inyectar 0,1 ml de KAX/100 g de peso corporal del animal por vía intraperitoneal, utilizando una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja de 28 G.
- Permita que el animal quede inconsciente. Comprueba los reflejos pellizcando las patas y la cola.
- Mantenga a todos los animales seguros en el laboratorio durante la cirugía.
- Después de la cirugía, reemplace a los animales a sus jaulas y manténgalos cómodos a temperatura ambiente (RT) hasta que se recupere la conciencia. Solo regrese a los animales a la instalación de animales cuando los animales se despierten y reanuden su comportamiento normal.
>4. Preparación para la cirugía y el montaje de microagujas
- Prepara una solución estéril de NaCl 2 M.
- Utilice un extractor de microelectrodos (Figura 1C) para extraer un tubo de borosilicato de pared delgada y pulido pesado de 0,86 mm de diámetro interior en dos microagujas de vidrio finamente cónicas (Figura 1D, Figura 1E).
- Rellene una microaguja del paso anterior con solución salina 2 M utilizando una aguja de jeringa de relleno y una jeringa de 1 ml (Figura 1B). Golpee las burbujas de aire de la punta del electrodo.
- Llene una segunda jeringa de 1 ml con 2 M de NaCl. Conecte una aguja de 18 G y luego conecte una longitud (aproximadamente 10 pulgadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Utilice el émbolo de la jeringa para llenar el tubo de polietileno con solución salina a través de la aguja.
- Cuando tanto la microaguja como el tubo estén llenos de solución salina, conecte cuidadosamente los dos. Elimine cualquier aire en la conexión entre ellos (Figura 2).
- Bisel finamente la punta de la microaguja raspándola muy ligeramente a contrapelo de una toalla de papel gruesa.
- Verifique la resistencia de la microaguja empujando suavemente el émbolo sobre la jeringa hasta que se pueda ver un fino chorro de líquido en la toalla de papel. El chorro de líquido no debe ser más ancho de 0,5 mm.
5. Preparación del animal
- Aplique 1 - 2 gotas de anestésico tópico en la córnea (solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína, USP, 0,5%). Espere hasta que no se produzca ningún reflejo ocular.
- Recorta los bigotes con unas tijeras.
- Sature un aplicador de punta de algodón con una solución de betadine y frote el área alrededor del ojo experimental.
- Con un microscopio, coloque un hemostático para sujetar el párpado inferior y abultar el ojo, exponer la vena epiescleral y restringir el movimiento ocular. (Figura 3, punta de flecha)
>6. Inyección de solución salina inductora de glaucoma
- Cuando el conjunto de la microaguja y el animal estén preparados, comience las inyecciones.
- Cuando se confirme que el animal no responde al pellizco de las patas/cola, perfore cuidadosamente la vena epiescleral con la microaguja acercándola en un ángulo bajo entre 10 y 20 grados con respecto a la vena (Figura 3, flecha blanca). Una punción exitosa en la vena es evidente cuando la sangre ingresa a la punta de la microaguja (Figura 3, flecha negra).
- Inyecte lenta y manualmente aproximadamente 50 μl de solución salina en la vena. Esto debería tardar aproximadamente 10 segundos. Las venas se blanquearán a medida que la sal circule a través de la vasculatura (Figura 4, punta de flecha). Algunas regiones pueden mantener una apariencia de color rojo sangre (Figura 4, flecha).
- Realice una segunda inyección en la vena, opuesta al sitio de la primera, para asegurar un daño completo de la retina a toda la capa de células ganglionares >
- Deje el ojo opuesto sin tratar para usarlo como control interno.
