Aislamiento de fibrillas de amiloide a partir de extracto de tejido cerebral

Resumen

Fuente: Upadhyay, A. et al., Purificación bioquímica y caracterización proteómica de núcleos de fibrillas amiloides del cerebro. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el protocolo para aislar fibrillas de amiloide del extracto de tejido cerebral de ratón utilizando centrifugación en gradiente de densidad y digestión de proteínas no amiloides.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Recolección de tejidos y purificación de amiloide

>NOTA: Idealmente, las fibrillas de amiloide deben aislarse de regiones cerebrales recién disecadas. Sin embargo, este método también funciona bien con tejidos cerebrales congelados o ultracongelados. A continuación se muestra un breve resumen de los tejidos cerebrales de congelación instantánea para su almacenamiento y uso posterior.

1. Recolección y almacenamiento de tejido cerebral: Diseccione cerebros de ratones y recoja rápidamente las regiones cargadas de amiloide (es decir, la corteza y el hipocampo), seguido de una congelación instantánea en nitrógeno líquido o un baño >nota: La congelación instantánea ayuda a preservar los atributos estructurales de los constituyentes del tejido. Los ratones son sacrificados por isoflurano y luxación cervical. Se aconseja evitar el uso de CO₂, ya que puede comprometer la integridad del proteoma cerebral.
2. Después de la disección, corte y almacene los tejidos frescos en bloques pequeños (por ejemplo, 5 mm x 5 mm), ya que esto facilita una homogeneización más eficiente antes de la extracción de amiloide. Transfiera el tejido al vial criogénico estéril, apriete su tapa y sumérjalo rápidamente.
3. Mantenga los tejidos congelados en condiciones ultrafrías (es decir, -80 °C o nitrógeno líquido). Si la extracción se va a realizar unos días más tarde, almacene los tejidos a -20 °C y evite los ciclos de congelación y descongelación. Descongele los tejidos congelados en hielo húmedo cuando estén listos para la extracción y purificación.
   nota: El contacto directo de los tejidos con el nitrógeno líquido puede causar daños en los tejidos y las proteínas. Tenga en cuenta que un baño con alcohol puede eliminar los marcadores permanentes de las etiquetas de los tubos.

>2. Enriquecimiento de material insoluble en dodecil sulfato de sodio (SDS)

NOTA: Realice todos los pasos en hielo y centrifugue a 4 °C, a menos que se indique lo contrario. Los fabricantes y los números de catálogo de productos químicos e instrumentos se proporcionan en la Tabla de materiales.

1. Comience con regiones de tejido cerebral recién diseccionadas o congeladas (descongeladas en hielo) colocadas en un tubo de 2 ml que contenga 6-8 perlas de cerámica y tampón de homogeneización helado recién preparado (1 ml para 0,25-1 g de masa de tejido húmedo).
2. Transfiera los tubos al homogeneizador del molino de bolas y muela el contenido del tejido a 4000 rpm, con dos ciclos de 30 s cada uno y un intervalo de 30 s entre ellos.
   nota: Alternativamente, se pueden utilizar sistemas de agitación u homogeneización motorizados para moler y homogeneizar los tejidos.
3. Agregue 9 mL de tampón de homogeneización helado a 1 mL de homogeneizado de tejido entero cerebral en tubos de 15 mL, selle con tiras de película de cera de laboratorio y gire de extremo a extremo durante la noche a 4 °C para garantizar una solubilización robusta.
   nota: Para eliminar los residuos celulares grandes y los lípidos no deseados, a la mañana siguiente, haga girar los tubos a 800 x g a 4 °C durante 10 minutos y recoja el sobrenadante en un tubo nuevo. Vuelva a suspender el pellet restante en 2 ml de tampón de homogeneización helado, mezcle bien, vuelva a centrifugar durante 10 minutos a 4 °C y combine los dos sobrenadantes.
4. Añadir lentamente sacarosa sólida a la suspensión de extracto tisular hasta una concentración final de 1,2 M, mezclar bien y centrifugar a 250.000 x g durante 45 min a 4 °C.
5. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender el pellet en 2 mL de tampón de homogeneización que contenga 1,9 M de sacarosa mediante trituración, seguida de centrifugación a 125.000 x g durante 45 min a 4 °C.
   nota: El volumen del tampón se puede ajustar en función de la cantidad de material recuperado del paso anterior. En general, 10 volúmenes de tampón de homogeneización (V/V) es ideal para este paso.
6. Recoja la capa sólida blanca superior con una pipeta, transfiérala a un tubo nuevo y solubilice en 1 ml de tampón de lavado helado pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces, sin introducir burbujas de aire.
7. Además de la capa superior, el pellet también está enriquecido con fibrillas de amiloide. Para obtener un mayor rendimiento, combine las dos fracciones y continúe. Retire con cuidado la capa acuosa intermedia con una pipeta y deséchela.
8. Centrifugar las fracciones combinadas a 8000 x g durante 20 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
9. Agregue 1 mL de tampón de digestión helado al pellet lavado, vuelva a suspender e incube a temperatura ambiente (RT) durante 3 h.
10. Centrifugar a 8000 x g durante 20 min a 4 °C y eliminar el sobrenadante con una pipeta.
11. Vuelva a suspender y lavar (igual que en el paso 2.8) el pellet digerido dos veces en 1 ml de tampón Tris helado.
12. Vuelva a suspender el pellet lavado en 1 mL de tampón de solubilización que contenga 1% de SDS y 1,3 M de sacarosa pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar rápidamente a 200.000 x g durante 60 min a 4 °C.
    nota: Aunque las fibrillas de amiloide son muy resistentes a los detergentes y desnaturalizantes, las exposiciones muy prolongadas al detergente (1% de SDS) pueden afectar a la integridad de las fibrillas o eliminar las proteínas fuertemente unidas, lo que comprometerá los análisis posteriores. Por lo tanto, inmediatamente después de resuspender los pellets, proceda a la centrifugación.
13. Guarde el pellet y aumente el volumen del sobrenadante restante añadiendo 50 mM de tampón Tris (en una proporción de 1:0,3) para reducir la concentración de sacarosa de 1,3 a 1 M y centrifugar una vez más a 200.000 x g durante 45 min a 4 °C.
14. Disuelva los dos gránulos en 100 μL de tampón Tris que contenga 0,5% de SDS y agrupe para la purificación de amiloide. Los gránulos visibles son pequeños y deben aparecer opacos y blanquecinos (véase la Figura 1A).

Resultados

Figura 1: Confirmación de la extracción de amiloide mediante tinción bioquímica e imágenes de fibrillas de amiloide. (A) El pellet insoluble SDS enriquecido que contiene amiloide tiene un color blanquecino opaco. (B) tinción roja Congo del sobrenadante soluble SDS y pellet insoluble en SDS que contiene amiloide purificado secado en una membrana de nitrocelulosa de 0,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Inhibito de la proteasa	Termo Científico	164535	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C1016	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
colagenasa	Sigma-Aldrich	C0130	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
Cóctel completo de inhibidores de proteasas	Sigma-Aldrich	11697498001	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	EN0521	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
Motor del sistema de homogeneización de tejidos K54	Cole Parmer	Glas-Col 099C	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
Ultracentrífuga Optima L-90K	Beckman Coulter	BR-8101P-E	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
Homogeneizador de tejidos Precellys 24	Instrumentos Bertin	P000062-PEVO0-A	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	74255	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
Microcentrífuga Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Fisher Scientific	75002446	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	Se pueden utilizar instrumentos alternativos, productos químicos y anticuerpos de otros fabricantes