Una inyección intracerebroventricular para analizar la distribución del citomegalovirus murino en el cerebro de un ratón neonatal

Resumen

Fuente: Kawasaki, H., et al. Inyección intracerebroventricular e intravascular de partículas virales y microesferas fluorescentes en el cerebro neonatal. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra el proceso de inyección intracerebroventricular para estudiar la distribución del citomegalovirus murino (MCMV) en el cerebro de ratón neonatal. El MCMV, diseñado para expresar una proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) para mayor visibilidad, se inyecta en el ventrículo lateral del cerebro de un cachorro de ratón. El virus inyectado circula a través del líquido cefalorraquídeo, infectando las células de la región periventricular, incluida la zona marginal, el plexo coroideo y la zona subventricular.

Protocolo

>1. Inyección ICV de MCMV y microperlas fluorescentes en ratones neonatos

1. Mantenga ratones ICR normales preñados en una instalación con temperatura controlada bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los neonatos se designan como P 0,5 el día del nacimiento.
2. Esterilizar una jeringa de 10 μl y una aguja de 27 g con alcohol al 70%.
3. Cargue la solución inyectable (5 μl) que contiene MCMV o microperlas fluorescentes en la aguja tirando con cuidado del émbolo de la jeringa.
4. Sujete al ratón neonatal (P 0,5) poniéndolo en hielo durante 3 a 4 min. Una vez que el animal esté bajo anestesia, use el método de respuesta de pellizco para determinar la profundidad de la anestesia.
5. Marque el lugar de la inyección con una pluma de laboratorio no tóxica en un lugar de aproximadamente 0,7 a 1,0 mm lateral a la sutura sagital y de 0,7 a 1,0 mm caudal del bregma neonatal (Figura 1A).
6. Inserte la aguja a 2 mm de profundidad, perpendicular a la superficie del cráneo en el lugar de inyección marcado. Como referencia, marque a 2 mm de la punta de la aguja con una máquina no tóxica.
7. Inyecte lentamente 5 μl de MCMV (aproximadamente 5 × 10⁵ UFP) en el ventrículo lateral sin abrir el cuero cabelludo (Figura 1B).
8. En otro grupo de ratones, inyectar una solución de 5 μl que contenga microperlas fluorescentes (0,1 - 0,3 μm, aproximadamente 5,75 × 10⁸ partículas) por el mismo método.
9. Retire lentamente la aguja de 10 a 20 segundos después de interrumpir el movimiento del émbolo para evitar el reflujo.
10. Para recuperarse, mantenga a los ratones durante 5 a 10 minutos en un recipiente caliente hasta que se restablezca el movimiento y la capacidad de respuesta general.
11. Recoja los cerebros en un rango de puntos de tiempo (3, 12, 24, 48 y 72 horas) después de la inyección.

Resultados

Figura 1: Sitios de inyección del ratón neonatal. (A, B) Inyección de ICV de 5 μl de MCMV (aproximadamente 5 × 10⁵ PFU) o de 5 μl de microperlas (aproximadamente 5,75 × 10⁹ partículas). (A) El sitio de inyección está en el punto medio entre la oreja y el ojo (en una ubicación de aproximadamente 0,7 a 1,0 mm lateral a la sutura sagital y de 0,7 a 1,0 mm caudal de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Rojo Nilo 0.04-0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Rojo Nilo 0.1-0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Rojo Nilo 1.7-2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% suero de ratón	DAKO	X0910
Ratón C57BL/6	SLC, Inc.
Ratón ICR	SLC, Inc.
Jeringas de microlitros modificadas (serie 7000)	Compañía Hamilton
Aguja de calibre 35	Saito Médico
Vector pEGFP-N1	Clontech	#6085-1