Evaluación de la respuesta de las interneuronas a las señales quimioatractivas de las células endoteliales periventriculares

Resumen

Fuente: Datta, D., et al. Ensayos de migración, quimioatracción y cocultivo para células endoteliales derivadas de células madre humanas y neuronas GABAérgicas. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra un método para probar la migración de interneuronas en respuesta a señales quimioatractivas de las células endoteliales periventriculares (PVECs). Las interneuronas se colocan en un compartimento central, con PVEC y células de control a ambos lados. El aumento de la migración hacia las PVEC indica una respuesta positiva a sus señales quimioatractivas.

Protocolo

1. Ensayo de quimio-atracción

1. Coloque un inserto de cultivo de tres pocillos en el centro de un plato de 35 mm recubierto de poli-L-ornitina/laminina con pinzas estériles.
2. Dale la vuelta al plato. Marque el límite alrededor del compartimento central de la plaquita con un rotulador negro permanente con una punta ultrafina.
3. Semilla 3 x 10^{4 interneuronas} GABAérgicas humanas en el compartimento medio en 70 μL de medio neuronal (Figura 1A).
4. Siembra 10^{4 células} endoteliales periventriculares humanas en 70 μL de medio de células endoteliales periventriculares y 10⁴ células endoteliales de control en 70 μL de medio de células endoteliales de control en los dos compartimentos exteriores, respectivamente (Figura 1A).
5. Añadir 1 mL de medio de cocultivo (50% de medio de mantenimiento periventricular sin GABA y 50% de medio neuronal) a lo largo del lateral de la placa para evitar que el recubrimiento de la placa se seque.
6. Revise bajo un microscopio para verificar que las células no estén goteando del compartimiento del inserto.
7. Incubar las células durante 24 h a 37 °C y 5% de CO₂. Después de 24 h de incubación, revise bajo un microscopio para verificar que las células se hayan adherido correctamente y que no haya fugas.
8. Después de 48 h de siembra, retire suavemente el inserto con una pinza estéril. Revise bajo el microscopio para verificar que la capa celular no esté alterada (día 0).
9. Retire el medio y agregue 1 mL de medio de cocultivo fresco.
   NOTA: Reserve un número requerido de platos para las imágenes del día 0.
10. Incubar las células durante 36 h a 37 °C y 5% de CO₂. Después de 36 h, aspire el medio, fije las células con PFA al 4% durante 10 minutos y lave 3 veces con PBS 1x.
11. Tiñir interneuronas GABAérgicas humanas con anti-β-Tubulina humana o anticuerpo MAP2 humano. Al final del procedimiento de tinción, agregue 1 ml de medio de montaje antidecoloración a cada plato.

>2. Imágenes y análisis de datos

1. Coloque la placa de ensayo inmunoteñida bajo un microscopio con un aumento de 4X.
2. Mantenga un borde largo del límite rectangular (hecho en el paso 5.10 anterior) en el campo de visión. Tome imágenes de las celdas en el espacio libre de celdas adyacente a ese límite. Adquiera imágenes a lo largo del borde largo derecho y el borde largo izquierdo del límite rectangular.
   NOTA: Las celdas colocadas en diagonal con respecto al rectángulo no se tienen en cuenta debido a la ambigüedad al seleccionar el borde corto o largo como marca de inicio. Además, el número de células que migran a través del borde corto suele ser significativamente menor (posiblemente debido a un menor número de células iniciales a lo largo del borde corto) y no se tienen en cuenta.
3. Abra las imágenes en ImageJ. Calcule la distancia entre cada celda y la marca de límite utilizando ImageJ.
4. Para evaluar la migración en términos de números de celda, establezca una distancia específica desde el límite en la imagen adquirida en ImageJ. Cuente el número de celdas que están presentes dentro de esta distancia. Calcular el número promedio, devia estándar
5. y la significación estadística utilizando el software adecuado.

Resultados

Figura 1: Ensayo de quimio-atracción. (A) Esquema del ensayo de quimio-atracción. Utilizando un inserto de cultivo de tres pocillos, las interneuronas (IN) se sembraron en el centro (rectángulo punteado verde), mientras que las células endoteliales periventriculares (PV ECs; rectángulo punteado naranja) y las células endoteliales de control (ECs; rectángulo punteado amarillo) se sembraron a ambos lad...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Controlar las células endoteliales humanas	Dinámica Celular	R1022
Suplemento de medio de células endoteliales de control	Dinámica Celular	M1019
DMEMF/12 medio	Thermofisher Científico	11320033
E6 medio	Thermofisher Científico	A1516401
FGF2	Thermofisher Científico	PHG0261
Fibronectina	Thermofisher Científico	33016-015
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacitómetro	Sigma-Aldrich	Z359629
Neuronas GABAérgicas humanas	Dinámica Celular	R1013
Medio base de neuronas GABAérgicas humanas	Dinámica Celular	M1010
Neurona GABAérgica humana Suplemento neuronal	Dinámica Celular	M1032
Laminina	sigma	L2020
Medio de montaje	Laboratorios de vectores	H-1200
poli-L-ornitina	sigma	Pág. 4957
Pbs	Thermofisher Científico	Año 14190
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Kit Completo Mediano	Tecnologías de células Lifeline	LL-0003	Componente del medio de células endoteliales humanas de control
Inserto de cultivo de silicona de 3 pocillos	Ibidi	80369
Plato de 35 mm	Corning	430165
Solución de PFA al 4%	Fisher Científico	AAJ19943K2
Microscopio de contraste de fase invertida	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Microscopio fluorescente	Olimpo	FSX-100
Anticuerpo anti-β-tubulina humana	Bioleyenda	802001
Anticuerpo anti-MAP2	Neurómica	CH22103