Inmunoprecipitación de complejos proteína-ADN diana a partir de lisado de neuronas motoras

Resumen

Fuente: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. Mapeo de alta resolución de las interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre de ratón utilizando inmunoprecipitación-exonucleasa de cromatina (ChIP-Exo). J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la inmunoprecipitación de fragmentos de ADN reticulados con la proteína diana de lisados de neuronas motoras derivadas de células madre utilizando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos de proteína diana.

Protocolo

NOTA: Se recomienda agua destilada y desionizada esterilizada en autoclave (ddH₂O) para hacer tampones y mezclas maestras de reacción.

1. Recolección y reticulación de células

1. Después de diferenciar las células madre embrionarias de ratón (ES) en neuronas postmitóticas, agregue un 11% de formaldehído a las células recolectadas hasta una concentración final del 1% (v/v). Células de roca en una plataforma oscilante (un balancín, un agitador o un rotador) durante 15 min, a temperatura ambiente (RT, 25 °C).
   nota: Dependiendo de la proteína objetivo que se vaya a reticular, se puede utilizar menos reticulación de formaldehído (por ejemplo, una concentración final del 0,5%) o doble reticulación con glutarato de disuccinimidil (DSG).
2. Agregue 2,5 M de glicina a una concentración final de 150 mM para detener la reacción de reticulación. Células de roca en una plataforma mecedora en RT, durante 5 min.
3. Centrifugar las células reticuladas en tubos cónicos de 15 mL a RT, durante 6 min, a 1.350 x g. Aspire la solución, luego vuelva a suspender las células en 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x.
   nota: Los pellets de celda reticulada pueden almacenarse a -80 °C después de la congelación instantánea con nitrógeno líquido.

>2. Lisis celular

NOTA: Los siguientes pasos de este protocolo son para aproximadamente 2 x 10⁷ células neuronales diferenciadas de las células madre embrionarias de ratón. Para romper las celdas, se utilizarán tampones de lisis que contienen varios detergentes. Agregue 50 μL de caldo de inhibidor de proteasa (CPI) completo 1000x a 50 mL de tampón justo antes de usar.

1. Prepare los tampones de lisis 1-3 como se describe en la Tabla 1.
2. Descongele los gránulos de células reticuladas en hielo, luego vuelva a suspender completamente los gránulos de celdas en 3 mL de tampón de lisis 1 en tubos cónicos de 15 mL. Mece a 4 °C durante 15 min sobre una plataforma mecedora. Centrifugar a 1.350 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar sobrenadante.
3. Vuelva a suspender completamente las células peletizadas en 3 mL de tampón de lisis 2. Mece a 4 °C durante 10 min sobre una plataforma mecedora. Centrifugar a 1.350 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar sobrenadante.
4. Agregue 1 ml de tampón de lisis 3 a cada pellet, luego manténgalo en hielo. Proceda inmediatamente a la sonicación.

>3. Cromatina sonicante

NOTA: Mantenga las muestras en hielo o a 4 °C durante este procedimiento de sonicación para reducir la inversión de la reticulación.

1. Con una espátula estéril, añadir perlas de sonicación (Tabla de Materiales) hasta la marca de graduación de 0,2 mL en tubos de poliestireno de 15 mL. Lave las perlas de sonicación mediante vórtice en 600 μL de 1x PBS hasta que no queden manchas secas visibles. Centrifugar los tubos durante 5 s a 30 x g y aspirar 1x PBS.
   nota: La sonicación en tubos de poliestireno es más eficiente que la sonicación en tubos de polipropileno. Si se sonica un número menor de células (por ejemplo, <10⁶ células), utilice tubos de poliestireno de 1,5 ml sin añadir perlas de sonicación.
2. Vuelva a suspender completamente los lisados nucleares en 1 mL de tampón de lisis 3 (del paso 2.4) y, a continuación, transfiéralos a los tubos de poliestireno de 15 mL que contienen perlas de sonicación. Vórtice brevemente los tubos de poliestireno.
3. Para fragmentar el ADN de la cromatina reticulada, sonicate los lisados nucleares a 4 °C durante un número optimizado de ciclos, con una amplitud de potencia de 30 W y ciclos de sonicación ajustados a 30 s encendido/30 s apagados
   nota: La optimización de la sonicación para cada tipo de célula y lote dará como resultado el mejor rendimiento de inmunoprecipitación-exonucleasa de cromatina (ChIP-exo). Para 2 x 10⁷ células neuronales de ratón, 20-30 ciclos de sonicación con los ajustes mencionados fragmentarán la cromatina en el rango de 100-500 pb.
4. Una vez finalizada la sonicación, transfiera todo el sobrenadante (lisados sonicados), de cada muestra, a tubos de 1,5 mL. Añadir un 10% de 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol) a cada muestra a una concentración final del 1%. Mezclar por pipeteo.
5. Para granular los restos de células, centrifugar las muestras a 13.500 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera todos los lisados sonicados (sobrenadante) de cada muestra a nuevos tubos de 1,5 mL.
6. Tome 30 μL de lisado sonicado de cada muestra (~3% de lisado sonicado) y añádalo a los nuevos tubos de 1,5 mL para comprobar la sonicación. Almacene los lisados sonicados restantes a 4 °C hasta que estén listos para la incubación con perlas recubiertas de anticuerpos.

>4. Comprobación de la sonicación

1. Prepare 20 mL de tampón 2x proteinasa K añadiendo 2 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), 2 mL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M, 10 mL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% y 6 mL de ddH₂O esterilizado en autoclave. No agregue CPI a este búfer. Almacenar en tubo de 50 mL en RT.
2. Para invertir la reticulación proteína-ADN, eliminando las proteínas, se toman los 30 μL de cromatina sonicada de cada muestra (del paso 3.6), se añaden 166 μL de ddH₂O esterilizado en autoclave, 200 μL de tampón 2x proteinasa K y 4 μL de 20 mg/mL de proteinasa K. Agitar brevemente las muestras y, a continuación, incubar a 65 °C durante 1-3 h a 24 x g.
3. NOTA: Los lisados sonicados pueden reticularse inversamente a 65 °C durante la noche.
4. Extraiga el ADN utilizando fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (PCIA: 25:24:1) y el método de precipitación de etanol de la siguiente manera.
   cautela: El PCIA es tóxico. Úselo debajo de una campana extractora con equipo de protección personal (EPP) estándar.
   1. Añadir 400 μL de PCIA a cada muestra en tubos de 1,5 mL, ajustar el vórtice a la velocidad máxima y las muestras de vórtice durante 20 s. Centrifugar a 18.400 x g durante 6 min a RT. Se observarán dos fases. Transfiera con cuidado la capa acuosa superior (fase clara) de cada muestra a nuevos tubos de 1,5 mL.
   2. Añadir 1 μL de 10 mg/mL de ARNasa A. Incubar las muestras a 37 °C durante 30 min.
   3. Agregue 1 μL de 20 mg/mL de glucógeno a cada muestra, luego precipite con 1 mL de etanol 100% helado (almacenado en un congelador a -20 °C). Mezclar brevemente y, a continuación, incubar las muestras en un congelador a -80 °C durante 30 minutos a 1 hora. Centrifugar las muestras a 18.400 x g durante 10 min a 4 °C y verter cuidadosamente etanol al 100%.
   4. Lave los pellets con 500 μL de etanol al 70% helado (almacenado en un congelador a -20 °C). Centrifugar a 18.400 x g durante 5 min a 4 °C. Vierta con cuidado etanol al 70%.
   5. Incubar las muestras en tubos de 1,5 mL a 50 °C hasta que se evapore el etanol restante. Resuspenda los gránulos de ADN en 15 μL de ddH2O esterilizado en autoclave o ddH2O sin nucleasas.
   6. Pase las muestras de ADN extraídas, junto con una escalera de ADN, en un gel de agarosa al 1,5% a 120-180 V y compruebe el tamaño del ADN sonicado.

>5. Incubación de anticuerpos con perlas

NOTA: Los siguientes pasos de este protocolo son para aproximadamente 2 x 10⁷ células neuronales diferenciadas de las células madre embrionarias de ratón. No congele ni descongele las perlas magnéticas en ningún momento durante el protocolo ChIP-exo, ya que las perlas pueden agrietarse y contaminar la muestra o comprometer el rendimiento del anticuerpo.

1. Después de la lisis celular y la sonicación, prepare las perlas magnéticas de proteína G (tabla de materiales) para ChIP, mezcle las perlas magnéticas hasta que queden homogéneas, luego agregue 25 μL de perlas magnéticas a 2 mL de tubos de proteína de baja unión.
   NOTA: El tipo de perlas magnéticas utilizadas dependerá de la especie de los anticuerpos.
2. Lave las perlas con 1 mL de solución de bloqueo (Tabla 1), mezcle bien, luego colóquelas en una rejilla magnética durante 1 minuto. Mientras aún está en una rejilla magnética, retire el sobrenadante una vez que esté claro.
3. Agregue 1 mL de solución de bloqueo a las perlas magnéticas. Tubos de roca durante 10 min a 4 °C sobre una plataforma mecedora. Gire brevemente, luego coloque los tubos en una rejilla magnética y retire el sobrenadante.
4. Repita el paso 5.3 dos veces más.
5. Agregue 500 μL de solución de bloqueo a las perlas magnéticas. Hacer girar brevemente el anticuerpo contra Isl1 (0,04 μg/μL, Tabla de materiales), luego agregue 4 μg de anticuerpo a los tubos de baja unión a proteínas correspondientes de 2 mL que contienen las perlas magnéticas en la solución de bloqueo.
6. Repita el paso 5.5 sin anticuerpos (es decir, el control sin anticuerpos para ChIP).
   nota: La cantidad de anticuerpo a añadir puede determinarse empíricamente teniendo en cuenta la calidad del anticuerpo y el número de células utilizadas para ChIP.
7. Muestras de roca a 4 °C durante 6-24 h en una plataforma oscilante.

>6. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

1. Lave las perlas recubiertas de anticuerpos del paso 5.8 con 1 ml de solución bloqueante. Coloque las muestras en una plataforma oscilante a 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante.
2. Repita el paso 6.1 dos veces más.
3. Vuelva a suspender las perlas recubiertas de anticuerpos en 50 μL de solución bloqueante, luego transfiéralas a nuevos tubos de baja unión a proteínas de 2 mL. Para cada muestra de ChIP, añadir lisados sonicados (~1,0 mL desde el paso 3.6) a perlas recubiertas de anticuerpos en tubos de baja unión a proteínas de 2 mL.
4. Incubar cada muestra en una plataforma oscilante durante la noche a 4 °C.

>7. Lavados ChIP

NOTA: Mantenga las muestras en hielo o a 4 °C para mantener la reticulación proteína-ADN durante los lavados ChIP.

1. Prepare tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado de LiCl y 10 mM de tampón Tris-HCl (pH 7,4) como se describe en la Tabla 2. Almacene en tubos de 50 ml a 4 °C. Agregue 50 μl de material CPI 1000x a todos los tampones justo antes de usar.
2. Haga girar brevemente las muestras en tubos de baja unión a proteínas de 2 ml para recoger el líquido de los tapones, luego colóquelas en una rejilla magnética durante 1 minuto y retire el sobrenadante con cuidado con una pipeta.
3. Para los lavados con ChIP, añadir 1 mL de tampón de lisis 3 (a 4 °C) a cada tubo. Mezclar en una plataforma mecedora a 4 °C durante 5 min. Centrifugar brevemente las muestras, luego colóquelas en una rejilla magnética durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
4. Agregue 1 mL de tampón de lavado frío con alto contenido de sal a cada tubo. Mezclar en una plataforma mecedora a 4 °C durante 5 min. Centrifugar brevemente las muestras, luego colóquelas en una rejilla magnética durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
5. Agregue 1 ml de tampón de lavado LiCl frío a cada tubo. Mezclar en una plataforma mecedora a 4 °C durante 5 min. Centrifugar brevemente las muestras, luego colóquelas en una rejilla magnética durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
6. Agregue 1 mL de tampón Tris-HCl frío de 10 mM (pH 7.4) a cada tubo. Mezclar en una plataforma mecedora a 4 °C durante 5 min. Centrifugar brevemente las muestras, luego colóquelas en una rejilla magnética durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
   nota: Se puede utilizar tampón Tris-EDTA (pH 8,0) en lugar de tampón Tris-HCl (pH 7,4).

Tabla 1: Recetas para tampones de lisis 1-3 y tampón de bloqueo. Almacene en tubos de 50 ml a 4 °C. Agregue 50 μl de caldo 1000x CPI (inhibidor completo de la proteasa) a todos los tampones justo antes de usar.

Tampón de lisis 1
Reactivo	Volumen (mL)	[Final]
1 M HEPES (pH 7,3)	2.5	50 mM
5 M de NaCl	1.4	140 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0.1	1 mM
50% Glicerol	10	10%
10% Etoxilato de octilfenol	2.5	0.50%
10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol	1.25	0.25%
Esterilizado en autoclave ddH2O	Llenar hasta 50
Tampón de lisis 2
Reactivo	Volumen (mL)	[Final]
0,5 m Tris-HCl (pH 8,0)	1	10 mM
5 M de NaCl	número arábigo	200 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0.1	1 mM
Esterilizado en autoclave ddH2O	Llenar hasta 50
Tampón de lisis 3
Reactivo	Volumen (mL)	[Final]
1 m Tris-HCl (pH 8.0)	0.5	10 mM
5 M de NaCl	1	100 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0.1	1 mM
10% Ácido desoxicólico	0.5	0.10%
Solución de sal sódica de N-lauroilsarcosina al 30%	0.83	0.50%
Esterilizado en autoclave ddH2O	Llenar hasta 50
Solución de bloqueo
Reactivo	importe	[Final]
Albúmina sérica bovina (BSA)	250 mg	0.50%
Inhibidor completo de la proteasa (CPI, 1000x)	50 μL	1 vez
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Llene hasta 50 mL

Tabla 2: Recetas para lavados ChIP: tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado LiCl y tampón Tris-HCl de 10 mM (pH 7,4). Almacene en tubos de 50 ml a 4 °C. Agregue 50 μl de material CPI 1000x a todos los tampones justo antes de usar.

Tampón de lavado con alto contenido de sal
Reactivo	Volumen (mL)	[Final]
1 M HEPES (pH 7,3)	2.5	50 mM
5 M de NaCl	5	500 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0.1	1 mM
10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol	5	1%
5% Ácido desoxicólico	1	0.10%
5% SDS	1	0.10%
Esterilizado en autoclave ddH2O	Llenar hasta 50
Tampón de lavado de LiCl
Reactivo	Volumen (mL)	[Final]
0,5 m Tris-HCl (pH 8,0)	número arábigo	20 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0.1	1 mM
1 M LiCl	12.5	250 mM
10% Etoxilato de octilfenol	2.5	0.50%
5% Ácido desoxicólico	5	0.50%
Esterilizado en autoclave ddH2O	Llenar hasta 50
10 mM Tampón Tris-HCl
Reactivo	Volumen (mL)	[Final]
1 M Tris-HCl (pH 7,4)	0.5	10 mM
Esterilizado en autoclave ddH2O	Llenar hasta 50

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa, UltraPura	Invitrogen	16500	Comprobación de la sonicación (sección 4.3.6)
Albúmina, suero bovino (BSA), libre de proteasas, aislamiento por choque térmico, mín. 98%	BioShop (Tienda Biológica)	ALB003	Solución de bloqueo
Anticuerpo contra Isl1	DSHB	39.3F7	Identificación de anticuerpos con perlas (sección 5.6)
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060010	cromatina sonicante (Sección 3.3)
centrífuga 5424 R	Eppendorf	5404000138	cromatina sonicante (sección 3.5), control de la sonicación (secciones 4.3.1, 4.3.3 y 4.3.4)
centrífuga 5804 R	Eppendorf	22623508	Células de recolección, reticulación y congelación (sección 1.3), lisis celular (secciones 2.2 y 2.3), cromatina sonicante (sección 3.1)
Cóctel Completo de Inhibidores de la Proteasa Mini y sin EDTA	Roche	4693159001	Se añade a todos los tampones, excepto al tampón de proteinasa K y al tampón de elución ChIP
Ácido desoxicólico Sal sódica	Fisher Científico	BP349	Tampón de lisis 3, tampón de lavado con alto contenido de sal y tampón de lavado LiCl
EDTA, 0,5 m, solución estéril, pH 8,0	BioShop (Tienda Biológica)	EDT111	Tampón de lisis 1-3, control de la sonicación (sección 4.1), tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado de LiCl y tampón de elución ChIP
Alcohol etílico anhidro, 100%	Alcoholes comerciales	P006EAAN	Comprobación de la sonicación (sección 4.3.3)
El formaldehído, 36,5-38%, contiene 10-15% de metanol	sigma	F8775	Celdas de recolección, reticulación y congelación (sección 1.1)
Glicerol, grado reactivo, min 99.5%	BioShop (Tienda Biológica)	GLY002	Tampón de lisis 1
Glicina, grado biotecnológico, mín. 99%	BioShop (Tienda Biológica)	GLN001	Células de recolección, reticulación y congelación (sección 1.2)
Glucógeno, grado de ARN	Termo Científico	R0551	Comprobación de la sonicación (sección 4.3.3)
HEPES, 1 M Solución Filtrada Estéril, pH 7.3	BioShop (Tienda Biológica)	HEP003	Tampón de lisis 1, tampón de lavado con alto contenido de sal
Cloruro de litio (LiCl), grado reactivo	Biotienda	LIT704	Tampón de lavado LiCl
Perlas magnéticas para ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (perlas magnéticas para ChIP)	Dynabeads Protein G (perlas magnéticas para ChIP)	Incubación de anticuerpos con perlas (Sección 5)
Bastidor magnético (imán DynaMag-2)	Invitrogen	12321D	Se utiliza en muchos pasos de las secciones: 5
Solución de sal sódica de N-laurolsarcosina, solución acuosa al 30%, ≥97,0% (HPLC)	sigma	61747	Tampón de lisis 3
Etoxilato de octilfenol (IGEPAL CA630)	BioShop (Tienda Biológica)	NO 999	Tampón de lisis 1 y tampón de lavado LiCl
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico, grado de biotecnología (25:24:1)	BioShop (Tienda Biológica)	PHE512	Comprobación de la sonicación (sección 4.3.1)
solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x	Corning	21040CV	Cosecha, reticulación y congelación de células (Sección 1.3) y cromatina sonicante (Sección 3.1), Incuación de anticuerpos con perlas (Sección 5.1)
Fuente de alimentación básica PowerPac	BioRad	1645050	Comprobación de la sonicación (sección 4.3.6)
Solución de proteinasa K, grado de ARN	Invitrogen	25530049	Comprobación de la sonicación (sección 4.2)
Libre de Rnasa A, Dnasa y Proteasa	Termo Científico	EN0531	Comprobación de la sonicación (sección 4.3.2)
Cloruro de sodio (NaCl), biorreactivo	sigma	S5886	Tampón de lisis 1-3, tampón de lavado con alto contenido de sal
Dodecil sulfato de sodio (SDS), grado de electroforesis	BioShop (Tienda Biológica)	SDS001	Comprobación de la sonicación (sección 4.1), del tampón de lavado con alto contenido de sal y del tampón de elución ChIP
Perlas de sonicación y tubos Bioruptor de 15 mL	Diagenode	C01020031	cromatina sonicante (secciones 3.1 y 3.2)
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	Sección 4.2, 4.3.2 y 4.3.5
Solución de clorhidrato de Trizma (Tris-HCl), certificado BioPerformance, 1 M, pH 7,4	sigma	T2194	Tampón Tris-HCl de 10 mM
Solución de clorhidrato de Trizma (Tris-HCl), certificado BioPerformance, 1 M, pH 8,0	sigma	T2694	Tampón de lisis 2, tampón de lisis 3, control de la sonicación (sección 4.1), tampón de lavado de LiCl y tampón de elución ChIP
Balancín de minitubo VWR, velocidad variable	VWR	10159-752	Se utiliza en muchos pasos en las secciones: 1, 2, 5, 6 y 7
2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol, Triton X-100, grado reactivo	BioShop (Tienda Biológica)	TRX506	Tampón de lisis 1, cromatina sonicante (sección 3.4) y tampón de lavado con alto contenido de sal