Inmunotinción con fluorescencia de cortes de organoides cerebelosos

Resumen

Fuente: Silva, T. P., et al., Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunotinción. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la tinción de inmunofluorescencia de cortes de organoides cerebelosos para identificar antígenos diana específicos expresados en varias neuronas cerebelosas, que son indicativos de la maduración de organoides.

Protocolo

1. Inmunotinción de cortes de organoides

1. Coloque los portaobjetos del microscopio que contienen secciones de organoides en un frasco de copación con 50 mL de PBS precalentado 1x, sosteniendo hasta 10 portaobjetos uno detrás del otro.
   nota: Todas las secciones de organoides deben sumergirse en líquido.
2. Incubar durante 45 min a 37 °C para desgelatinizar los portaobjetos.
3. Lavar 1 vez con 50 mL de 1× PBS durante 5 min en RT: Transfiera los portaobjetos a un frasco de copación que contenga 1× PBS fresco.
4. Transfiera los portaobjetos a un frasco de copling que contenga 50 mL de glicina recién preparada (Tabla 1) e incube durante 10 min en RT.
5. Transfiera los portaobjetos a un frasco de copling que contenga 50 mL de tritón al 0,1% (Tabla 1) y permeable durante 10 min a RT.
6. Lavar con 1× PBS durante 5 min 2 veces.
7. Prepare la placa de inmunotinción con papel de 3 mm empapado en 1× PBS. Seque los portaobjetos con un pañuelo de papel alrededor de las rodajas y colóquelos sobre papel de 3 mm. Con una pipeta Pasteur, cubra toda la superficie de los portaobjetos con una solución de bloqueo (Tabla 1), 0,5 mL por portaobjetos. Incubar durante 30 min en RT.
8. Retire el exceso de solución bloqueadora y seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas. Colocar 50 μL del anticuerpo primario (Tabla 2) diluido en solución bloqueante sobre las secciones y cubrir con los cubreobjetos. Coloque las rodajas en un plato de inmunotinción previamente preparado. Incubar durante la noche a 4 °C.
9. Transfiera los portaobjetos a un frasco de copación con 50 mL de TBST (Tabla 1), deje caer los cubreobjetos y lave con TBST durante 5 min 3 veces.
10. Colocar 50 μL del anticuerpo secundario diluido en solución bloqueante sobre las secciones y cubrir con los cubreobjetos. Coloque las rodajas en la placa de inmunotinción previamente preparada. Incubar durante 30 min en RT, protegido de la luz.
11. Transfiera los portaobjetos a un frasco de copación nuevamente y lave con 50 ml de TBST durante 5 minutos 3 veces.
12. Seque los portaobjetos con un pañuelo de papel alrededor de las rodajas y coloque las rodajas en una placa de inmunotinción previamente preparada. Con una pipeta Pasteur, añada 0,5 mL de solución DAPI por toda la superficie de los portaobjetos. Incubar durante 5 min en RT.
13. Repita el paso 1.9.
14. Seque cuidadosamente los portaobjetos con un pañuelo de papel. Agregue 50 μL de medio de montaje gota a gota a lo largo del portaobjetos y luego baje con cuidado un cubreobjetos en cada portaobjetos, doblándolo ligeramente para evitar burbujas.

Tabla 1: Soluciones para la preparación de organoides para criosección e inmunotinción. Se enumeran todos los componentes y volúmenes utilizados para preparar las soluciones utilizadas en la preparación de organoides para criosección e inmunotinción.

Gelatina/Sacarosa Concentración final: 7,5%/15% p/p	1. Pesar 15 g de sacarosa y 7,5 g de gelatina en un frasco de vidrio Schott estéril y mezclar bien 2. Precalentar el PBS 1x a 65 °C 3. Añadir PBS precalentado 1x hasta un peso final de 100 g y mezclar bien 4. Coloque la botella de vidrio Schott en una placa calefactora a 65 °C y agite hasta que la gelatina se derrita 5. Incubar a 37 °C hasta que la solución se estabilice
Glicina Concentración final: 0,1 M	Añadir 0,37 g de glicina a 50 ml de PBS 1x recién preparado.
Solución Triton Concentración final: 0,1 % p/v	1. Prepare un caldo Triton X-100 al 10 %: 5 g de Triton X-100 en 50 mL de PBS 1x 2. Agregue 0,5 mL de caldo Triton X-100 a 50 mL de PBS 1x.
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05 % p/v Tween-20	20 mL Tris 1 M 30 mL de NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (10 % de stock: 5 g de Tween-20 en 50 mL de agua) Llene hasta 1 L con agua.
Solución de bloqueo	Añadir 5 mL de suero fetal bovino (FBS, concentración final: 10 % v/v) a 50 mL de TBST.
Solución DAPI	Añadir 15 μL de solución madre DAPI (1 mg/mL) a 10 mL de agua destilada
Mowiol	1. Añadir 2,4 g de Mowiol a 6 g de glicerol y agitar durante 1 h en una placa precalentada a 50 °C 2. Añadir 6 mL de agua destilada y agitar durante 2 h 3. Añadir 12 mL de Tris 200 mM (pH 8,5) y agitar durante 10 min 4. Centrifugar a 5.000 × g durante 15 min5. Alícuota y almacenar a -20 °C.

Tabla 2: Anticuerpos primarios. Se enumeran los anticuerpos primarios, el clon y las diluciones optimizadas utilizadas para la inmunotinción.

anticuerpo	Especies hospederas	dilución
BARHL1	conejo	1/500
CALBINDIN	conejo	1/500
MAP2	ratón	1/1000
N-CADHERINA	ratón	1/1000
NESTINA	ratón	1/400
OLIG2	conejo	1/500
PAX6	conejo	1/400
SOX2	ratón	1/200
TBR1	conejo	1/200
TBR2	conejo	1/200
TUJ1	ratón	1/1000

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Papel de 3MM	WHA3030861	Merck
Anticuerpo anti-BARHL1	HPA004809	Anticuerpos Atlas
Anticuerpo anti-calbindina D-28k	CB28	Millipore
Anticuerpo anti-MAP2	M4403	sigma
Anticuerpo anti-N-cadherina	610921	Transducción BD
Anticuerpo anti-NESTIN	MAB1259-SP	I+d
Anticuerpo anti-OLIG2	MABN50	Millipore
Anticuerpo anti-PAX6	PRB-278P	Covance
Anticuerpo anti-SOX2	MAB2018	I+d
Anticuerpo anti-TBR1	AB2261	Millipore
Anticuerpo anti-TBR2	AB183991	Abcam
Anticuerpo anti-TUJ1	801213	Bioleyenda
Cubreobjetos 24x60mm	631-1575	VWR
DAPI	10236276001	sigma
Suero fetal bovino	A3840001	ThermoFisher
Gelatina de piel de vacuno	G9391	sigma
Tarro de vidrio para copling	E94	ThermoFisher
glicina	MB014001	NZYtech
Monotioglicerol	M6154	sigma
Mowiol	475904	Millipore	Medio de montaje
Tritón X-100	9002-93-1	sigma
Preadolescente-20	Página 1379	sigma
Portaobjetos de microscopio SuperFrost	12372098	ThermoFisher	Portaobjetos de microscopio de adherencia