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1. Creación de organoides cerebrales a partir de cultivo 2D iPSC / hESC (Día 0)
>Nota: Este protocolo asume que el mantenimiento de las células madre (SC) se lleva a cabo en medios de mantenimiento de células madre (SCMM) libres de xeno con un sustrato de vitronectina o Geltrex. Si se utiliza un medio de cultivo alternativo de células madre con alto contenido de proteínas, se recomienda hacer la transición de los cultivos SC a SCMM durante al menos dos pasos antes de iniciar la formación de organoides. El protocolo no ha sido probado con métodos de cultivo SC basados en alimentadores.
- Utilizando métodos regulares de mantenimiento de SC, lleve los cultivos a una confluencia del 50% al 70%. Por lo general, esto ocurre entre 3 y 4 días después del paso, aunque esto puede depender del método de cultivo y de la línea celular><.
nota: Se necesitan aproximadamente 2 pocillos de una placa de 6 pocillos para producir una placa completa de organoides de 96 pocillos.
- Inspeccione los cultivos mediante microscopía de campo claro con un aumento de 10X-20X para garantizar una morfología de colonia saludable, sin diferenciación detectable.
- Llevar SCMM a 37 °C en un baño de agua caliente y descongelar un vial de 50 μL de 50 mM Y-27632 (inhibidor de rocas) y 2 mL de reactivo de desprendimiento enzimático a temperatura ambiente.
- Prepare una placa de 96 pocillos con fondo en U de fijación ultra baja (ULA), una pipeta P200 multicanal y un depósito de reactivo de 25 mL.
- Alícuota 45 mL de SCMM en un tubo cónico de 50 mL y añadir 45 μL de 50 mM Y-27632. Mezclar bien triturando.
- Aspire al vacío los dos pocillos que contienen SC y añada rápidamente 1 ml de reactivo de desprendimiento sin enzimas a cada pocillo con una pipeta P1000. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C durante 4 min.
- Aspirar al vacío los pocillos tratados y añadir 1 mL de reactivo de desprendimiento enzimático a cada pocillo utilizando una pipeta P1000.
- Incubar la placa en una incubadora a 37 °C durante 5 minutos más.
- Retire la placa y examine los pocillos tratados. Golpee suavemente la placa para romper las células agregadas. Si todavía son visibles grandes grupos de células, incube la placa durante 2 minutos más a 37 °C. Repita este paso hasta que los grupos ya no sean visibles a simple vista.
- Una vez que las células estén correctamente disociadas, agregue 1 mL de SCMM a cada pocillo para desactivar las enzimas de disociación. Agrupe los 4 mL de suspensión celular en un tubo cónico de 50 mL y tome una pequeña alícuota para el recuento de células.
- Devuelva los pocillos restantes sin tratar de la placa de mantenimiento a la incubadora a 37 °C.
- Mientras cuenta, centrifuga la suspensión de la celda a 300 x g durante 5 min.
- Determine el número total de células y calcule la cantidad de solución SCMM + Y-27632 que se necesitará para lograr una suspensión de 60.000 células/mL.
- Aspire con cuidado el sobrenadante al vacío y agregue el volumen calculado de la solución SCMM + Y-27632. Mezclar de 5 a 10 veces con una pipeta de 5 ml, asegurando una suspensión celular uniforme.
- Transfiera inmediatamente la suspensión celular a un depósito de reactivo y pipetee 150 μL en cada pocillo de la placa de 96 pocillos con fondo en U de ULA utilizando una pipeta P200 multicanal. Esto produce 96 organoides individuales, cada uno de los cuales consta inicialmente de 9.000 células.
- Centrifugar la placa a 150 x g durante 1 min.
- Coloque la placa en una incubadora a 37 °C y no la moleste durante 48 h.
>2. Mantenimiento de organoides cerebrales (Día 2)
- Prepare 17 mL de SCMM con 17 μL de 50 mM Y-27643 en un tubo cónico de 50 mL. Calentar la solución SCMM + Y-27632 a 37 °C en un baño de agua caliente.
- Tome la placa organoide de la incubadora y, con una pipeta P200 multicanal ajustada a 75 μL, extraiga lentamente el medio desde el borde del pocillo en la primera fila. Una vez que se haya extraído el medio, expulse rápidamente el medio de regreso al pocillo para levantar las células sueltas y los organoides. Repita esto para cada fila.
nota: Esta técnica, en lo sucesivo denominada "dispersión", eleva los desechos celulares y el organoide a la suspensión. El organoide se hunde rápidamente hasta el fondo del pozo, mientras que los desechos más pequeños permanecen en suspensión, lo que permite eliminarlos con un cambio de medio. Esto ayuda a evitar que el organoide descanse en los desechos celulares durante el cultivo.
- Después de que todos los pocillos se hayan dispersado, espere 15 s para asegurarse de que los organoides se hayan hundido hasta el fondo de cada pozo.
- Aspire lenta y cuidadosamente 75 μL de medio de cada pocillo utilizando la pipeta multicanal P200 y dispense en un depósito de residuos.
nota: La mayoría de los usuarios aspiran ocasionalmente un organoide durante las tomas regulares. Esto puede ocurrir aproximadamente el 1% de las veces. Planifique en consecuencia para asegurarse de que suficientes organoides sobrevivan hasta los puntos de tiempo experimentales.
- Transfiera la solución SCMM + Y-27632 a un depósito de reactivos y dispense 150 μL en cada pocillo de organoide utilizando la pipeta P200 multicanal.
- Vuelva a colocar la placa en una incubadora a 37 °C.
>3. Mantenimiento de organoides cerebrales (Día 3)
- Calentar 17 mL de SCMM a 37 °C, esta vez sin Y-27643.
- Con la pipeta multicanal P200 ajustada a 100 μL, disperse todos los pocillos de la placa organoide (consulte el paso 2.2). Espere 15 segundos para asegurarse de que los organoides se hayan hundido hasta el fondo de sus pocillos.
- Prepare un depósito de residuos y transfiera el SCMM calentado a un depósito de origen.
- Aspire cuidadosamente 125 μL de medio de cada pocillo y reemplácelo con 150 μL de SCMM fresco con la pipeta P200 multicanal.
- Vuelva a colocar la placa en una incubadora a 37 °C.
>4. Mantenimiento de organoides cerebrales (día 4+)
>Nota: Realice este mantenimiento regular cada dos días hasta la infección.
- Antes de comenzar la alimentación el día 4, prepare el medio de inducción neural (NI).
- Descongele una alícuota de 250 μL de 2 mg/mL de heparina, junto con un vial de 5 mL de 100X N-2 Supplement. Agregue los 250 μL de heparina, 5 mL de 100X N-2 y 5 mL de 100X Mínimo de Aminoácidos Esenciales-No Esenciales (MEM-NEAA) a 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12) + GlutaMAX. Filtre estérilmente la solución mezclada en un filtro de 500 mL.
Nota: Mantenga el NI a 4 °C cuando no esté en uso; El NI dura hasta dos semanas antes de que se prepare el medio fresco.
- Calentar 17 mL de medio NI a 37 °C.
- Con la pipeta multicanal P200 ajustada a 100 μL, disperse todos los pocillos de la placa organoide (consulte el paso 2.2). Espere 15 segundos para asegurarse de que los organoides se hayan hundido hasta el fondo de sus pocillos.
- Prepare un depósito de residuos y transfiera el NI calentado a un depósito de origen.
- Aspire cuidadosamente 125 μL de medio de cada pocillo y reemplácelo con 125 μL de NI fresco con la pipeta P200 multicanal.
- Vuelva a colocar la placa en una incubadora a 37 °C.
>5. Infección por organoide con el virus del zika (ZIKV) (~Día 24)
NOTA: Después de aproximadamente 3 semanas de diferenciación, habrá grandes estructuras neuroepiteliales y rosetas visibles dentro del organoide que serán altamente susceptibles a la infección por ZIKV.
- Lleve la solución salina balanceada (EBSS) 1X de Earle's, la solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el NI a 37 °C en un baño de agua caliente.
- Diluir el ZIKV de concentración conocida en EBSS 1X hasta la multiplicidad de infección (MOI) de la infección objetivo.
nota: Se recomiendan titulaciones de diferentes MOIs para lograr una respuesta viral a la dosis. Esto puede variar según la cepa del virus; para ATCC VR-1838 y ATCC VR-1843, los valores típicos de MOI oscilan entre 0,1 y 10).
- Retire con cuidado todo el medio del pocillo del organoide con una pipeta P200 de un solo canal. Añada rápidamente 200 μL de PBS 1X a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal P200 para lavar los organoides.
- Retire con cuidado todo el medio del pocillo del organoide con una pipeta P200 de un solo canal. Agregue rápidamente 50 μL de 1X solución de EBSS solo (infección simulada) o del virus ZIKV al pocillo y asegúrese de que el organoide esté completamente sumergido. Repita el procedimiento para cada organoide que se vaya a infectar para el estudio.
- Vuelva a colocar la placa en una incubadora a 37 °C durante 2 h.
nota: La incubación de organoides infectados simulados durante este tiempo no debería afectar significativamente su crecimiento en comparación con los organoides no perturbados.
- Aproximadamente 30 minutos antes de que se complete la incubación viral, alícuota 25 mL de NI en un tubo cónico de 50 mL y llevar a 37 °C en un baño de agua caliente.
- Una vez completada la exposición viral, lavar los organoides con 200 μL de PBS 1X por cada pocillo, dejar que los organoides se asienten durante 15 s y, a continuación, eliminar 1X PBS con una pipeta P200 de un solo canal.
- Agregue 200 μL de NI fresco a cada pocillo y vuelva a colocarlo en la incubadora.
- Opcional: Para un punto de tiempo del día 0, se pueden obtener imágenes de los organoides una hora después de la infección.
- Continúe con el cultivo reemplazando 125 μL de NI cada dos días utilizando el método de dispersión (ver paso 4). Asegúrese de desechar adecuadamente los medios y las puntas gastados, ya que contienen partículas infecciosas de ZIKV.