1. Doble tinción FDA-PI y en cultivo de neuronas granulosas cerebelosas (CGN)
- Prepare la solución de trabajo de diacetato de fluoresceína-yoduro de propidio (FDA-PI) añadiendo 20 μL de solución madre de FDA (concentración final: 10 μg/mL) y 50 μL de solución madre de PI (concentración final: 50 μg/mL) en 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mezcle por vórtice y colóquelo en hielo.
nota: Prepare la solución de trabajo FDA-PI justo antes de usarla.
- Saque la placa de cultivo celular de la incubadora. Ponlo en hielo.
- Aspire el medio de cultivo y reemplácelo con PBS.
nota: El cambio de solución debe hacerse lenta y cuidadosamente. Evite tocar las células con las puntas de las pipetas.
- Aspire el PBS frío y reemplácelo con FDA-PI frío (500 μL/pocillo para placas de cultivo celular de 12 pocillos o 1 mL/pocillo para placas de cultivo celular de 6 pocillos). Dejar en hielo durante 5 min.
- Aspire el FDA-PI y agregue PBS frío (100 μL/pocillo para placas de cultivo celular de 12 pocillos o 50 μL/pocillo para placas de cultivo celular de 6 pocillos).
nota: No se debe permitir que las células se sequen al tomar imágenes.
- Tome imágenes con microscopía fluorescente. Utilice un filtro de excitación con una banda de paso de 450 - 490 nm. Detecte las emisiones de fluorescencia para FDA y PI a 520 y 620 nm, respectivamente. En las mismas condiciones, tome una imagen bajo luz normal utilizando el modo de contraste de fase de la microscopía fluorescente.
nota: Tome imágenes dentro de los 15 minutos posteriores a la FDA-PI. El tiempo de exposición es de 100-300 ms y la ganancia analógica es de 2,8x.
>2. Evaluación de la viabilidad neuronal
- Para la tinción doble FDA-PI, superponga las imágenes de las células detectadas después del filtrado por diferentes filtros de fluorescencia arrastrando la capa positiva de FDA sobre la capa positiva de PI en el software de edición de gráficos.
- Ajusta la opacidad de la capa positiva para la FDA introduciendo "50%" en el campo "Opacidad" del panel "Capas". Fusiona dos capas haciendo clic en el botón "Fusionar visible" en el menú "Capa". Establezca el contraste de las imágenes superpuestas ingresando "50" en el campo "Contraste" en "Imagen"| "Ajustes" | "Brillo/Contraste." Asegúrese de que no haya células dobles positivas de la FDA y PI en las imágenes superpuestas.
