Visualización de neuronas del cuerpo de hongo en cerebros de Drosophila mediante inmunotinción

Abstract

Fuente: Kelly, S. M., et al. Disección y tinción inmunofluorescente de cuerpo de hongo y neuronas fotorreceptoras en cerebros adultos de Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra un protocolo detallado de inmunotinción para visualizar defectos fenotípicos en los cuerpos de hongos de cerebros de Drosophila mutantes. El protocolo consiste en el uso de anticuerpos contra Fas2, una proteína implicada en la guía axonal que facilita el correcto desarrollo morfológico y funcional del cuerpo del hongo.

Protocol

>1. Procedimiento de fijación y tinción inmunofluorescente

1. Con una pipeta p200, transfiera los cerebros disecados de la placa de 9 pocillos a un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL lleno de 0,5 mL de paraformaldehído al 4% diluido en PTN (tampón de fosfato de sodio 0,1 M pH 7,2, surfactante no iónico al 0,1%). Al menos 10 a 15 cerebros del mismo genotipo se pueden combinar en un tubo de microcentrífuga. Todos los pasos restantes (hasta el montaje de los cerebros en portaobjetos) se completan en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml.
   cautela: El paraformaldehído (PFA) debe manipularse en una campana extractora. Los residuo....

Results

Figura 1. Montaje de cerebros en preparación para imágenes de inmunofluorescencia. (A) Los cerebros están montados en portaobjetos SuperFrost Plus con una cubierta de puente para evitar el aplanamiento del cerebro. Se adhieren dos cubreobjetos "base" a un portaobjetos SuperFrost Plus cargado positivamente con esmalte de uñas transparente y se colocan cerebros disecados entre ellos. Se coloca un cubre.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinzas de microdisección/pinzas	Ted Pella	505-NM
Platos de Sylgard	Instrumentación de Sistemas Vivos	DD-50-S-BLK	Disponible en amazon.com
Anticuerpo Fas2	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	1D4
Anticuerpo Chaoptin	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	24B10
Anticuerpo GFP	Laboratorio de Aves	GFP-1010
Alexa488 cabra anti-ratón Anticuerpo secundario	ThermoFisher	A-11001
Alexa488 cabra anti-pollo Anticuerpo secundario	ThermoFisher	A-11039
Alexa647 anticuerpo secundario anti-ratón de cabra	ThermoFisher	A-21236
20% de paraformaldehído	Servicios de microscopio electrónico	RT15713
VectaShield	Laboratorios Vectoriales	H-1000
Correderas SuperFrost Plus	ThermoFisher	99-910-01
Cubreobjetos	ThermoFisher	12-553-454
Tampón de fosfato Na monobásico	sigma	S3139
Tampón de fosfato de Na dibásico	sigma	S3264
Tritón X 100	sigma	X100-100ml
esmalte de uñas	Servicios de microscopio electrónico (EMS)	72180
Microscopio estereoscópico	Leica S6D con fuente de luz LED KL300
Plato de 9 pocillos (plato puntual)	VWR	89090-482
Nutator/Balancín	pescador	22-363-152 o 88-861-041
Plato de 35 mm	Genesee Científico	32-103
Sylgard	pescador	50-366-794
Kimwipe	pescador	06-666
Posibles tampones de fijación
Búfer PTN			0,1 M de NaFosfato, pH 7,2, 0,1% Triton-X-100, Por lo general, componen 0,5 L de tampón de NaFosfato 0,1M y alícuota 50 ml a la vez según sea necesario
Acciones de mosca disponibles en Bloomington
elav (c155)-GAL4		BL458	Controlador panneuronal GAL4
w*;;; OK107-GAL4		BL 854	Controlador GAL4 para todas las neuronas del cuerpo del hongo (la inserción de OK107-GAL4 está en el cromosoma 4)
y(1), w(67c23); c739-GAL4		BL 7362	Controlador GAL4 para lóbulos alfa y beta (en el cromosoma 2)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64305	Controlador GAL4 para lóbulos alfa y beta, también contiene UAS-CD8- GFP
w*; 201Y-GAL4		BL 4440	Controlador GAL4 principalmente para los lóbulos gamma del cuerpo del hongo (en el cromosoma 2)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64296	Controlador GAL4 para lóbulos gamma del cuerpo del hongo, también contiene UAS-CD8-GFP