>1. Procedimiento de fijación y tinción inmunofluorescente
- Con una pipeta p200, transfiera los cerebros disecados de la placa de 9 pocillos a un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL lleno de 0,5 mL de paraformaldehído al 4% diluido en PTN (tampón de fosfato de sodio 0,1 M pH 7,2, surfactante no iónico al 0,1%). Al menos 10 a 15 cerebros del mismo genotipo se pueden combinar en un tubo de microcentrífuga. Todos los pasos restantes (hasta el montaje de los cerebros en portaobjetos) se completan en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml.
cautela: El paraformaldehído (PFA) debe manipularse en una campana extractora. Los residuos de PFA deben guardarse y eliminarse adecuadamente. El veinte por ciento del paraformaldehído comprado en ampollas de vidrio puede alícuota en tubos de microcentrífuga y almacenarse a -20 °C hasta que se necesite.
- Dentro de una campana extractora, incube los cerebros en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos con balanceo a baja velocidad a temperatura ambiente.
- Después de la fijación, permita que los cerebros se asienten en el fondo del tubo de microcentrífuga por gravedad.
nota: Ocasionalmente, los cerebros pueden pegarse al lado del tubo de microcentrífuga. Si esto ocurre, suele ser útil rotar lateralmente el tubo entre el dedo índice y el pulgar o golpear suavemente el tubo en el banco para promover el hundimiento de los cerebros.
- Retire el fijador con una pipeta p1000 y realice dos lavados "rápidos" con 500 μL de PTN, permitiendo que los cerebros se asienten en el fondo del tubo de microcentrífuga entre lavados. Durante estos lavados rápidos, una vez que todos los cerebros se han asentado por gravedad en el fondo del tubo de microcentrífuga, el PTN se puede cambiar inmediatamente por tampón fresco; No se requiere tiempo de lavado adicional.
nota: Por lo general, es preferible dejar un tampón adicional en el tubo que arriesgarse a la extracción del cerebro. A menudo se requiere un examen cuidadoso de la punta de la pipeta para asegurarse de que no se haya extraído ningún cerebro por error del tubo. Si los cerebros se han pipeteado accidentalmente en la punta, dispenselos de nuevo en el tubo de microcentrífuga, espere a que los cerebros se asienten y luego continúe eliminando cualquier PTN restante.
- Después del último lavado rápido, utilice una pipeta p1000 para realizar tres lavados "largos": añadir 500 μL de PTN y lavar durante 20 min a temperatura ambiente en un balancín/nutador. Todos los futuros lavados "largos" deben ser de 20 minutos.
nota: Los cerebros fijos pueden almacenarse durante la noche a 4 °C en PTN después de estos lavados.
- Retirar el último lavado con una pipeta p1000 e incubar los sesos en un balancín o nutator a temperatura ambiente en 0,5 mL de solución bloqueante [PTN + 5% de suero de cabra normal (NGS)] durante al menos 30 min a temperatura ambiente.
- Los anticuerpos secundarios de cabra se utilizarán en los siguientes pasos del protocolo. Si se utilizan anticuerpos secundarios de otra especie, se debe utilizar suero normal de esa especie (en lugar de NGS) en las soluciones de bloqueo y anticuerpos.
- Con una pipeta p1000, retire la solución de bloqueo y añada el anticuerpo primario diluido en PTN (PTN + 5% NGS + anticuerpo primario diluido). Cuando se utiliza un anticuerpo primario por primera vez, la dilución óptima de ese anticuerpo debe determinarse empíricamente.
nota: Para visualizar las neuronas del cuerpo de los hongos, normalmente se utilizan anticuerpos que reconocen Fas2. Estos anticuerpos están disponibles en el Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB) como anticuerpo 1D4 y deben diluirse 1:20 en PTN + 5% de NGS.
- Incubar los cerebros en una solución primaria de anticuerpos en un balancín/nutator durante 2 - 3 noches a 4 °C.
- Después de la incubación con anticuerpos primarios, permita que los cerebros se asienten en el fondo del tubo de microcentrífuga y luego retire la solución de anticuerpos primarios.
- Con una pipeta p1000, realice 2 lavados "rápidos" y 3 lavados "largos" de 20 minutos con 0,5 ml de PTN como se describe anteriormente en los pasos 1.4 y 1.5, permitiendo cuidadosamente que los cerebros se asienten por gravedad en el fondo del tubo de microcentrífuga entre cada lavado.
- Incubar los cerebros durante 3 horas a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios apropiados marcados con fluorescencia. Los anticuerpos secundarios suelen diluirse en 0,5 mL de PTN + 5% de NGS a una concentración de 1:200.
nota: Una vez que se han añadido anticuerpos secundarios fluorescentes, los cerebros deben mantenerse en la oscuridad durante el resto del experimento.
- Después de la incubación secundaria de anticuerpos, permita que los cerebros se asienten en el fondo del tubo de microcentrífuga y elimine la solución de anticuerpos secundarios.
- Realice 2 lavados "rápidos" y 3 lavados "largos" de 20 minutos con 0,5 ml de PTN como se describe anteriormente en los pasos 1.4 y 1.5, permitiendo cuidadosamente que los cerebros se asienten en el fondo del tubo de microcentrífuga entre cada lavado.
- Después del tercer lavado "largo" de 20 minutos, utilice una pipeta p200 para eliminar la mayor cantidad de tampón posible.
- Agregue 75 μL de medio de montaje fluorescente anti-decoloración a los cerebros. Pipetee los cerebros y el medio de montaje en la punta de la pipeta una vez para mezclar. No invierta el tubo, ya que los cerebros pueden atascarse en la tapa o en los lados del tubo de microcentrífuga.
nota: Después de la suspensión de los cerebros en el medio de montaje, los tubos pueden envolverse en papel de aluminio para ralentizar el enfriamiento de fluoróforos y almacenarse a 4 °C durante la noche. Si es necesario, los cerebros pueden almacenarse durante varios días a 4 °C, pero lo ideal es montarlos en portaobjetos lo antes posible.
>2. Montaje de cerebros adultos de D. melanogaster en portaobjetos de microscopio e imágenes
- Construye un tobogán de "puente". Coloque dos cubreobjetos "base" a una distancia aproximada de 1 cm en un portaobjetos cargado positivamente. Asegúrese de que el lado cargado positivamente de la guía esté hacia arriba. Adherir los cubreobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas, como se muestra en la Figura 1A. Sellar los tres bordes exteriores de cada cubreobjetos de la base con esmalte de uñas suele ser útil para garantizar que los medios de montaje no se absorban debajo de estos cubreobjetos de la base. Deje que el esmalte de uñas se seque completamente (10 a 15 minutos) antes de continuar.
- Coloque el portaobjetos bajo el microscopio estereoscópico y pipetee la solución de medios de montaje que contiene los cerebros disecados en el espacio entre los dos cubreobjetos. Para proporcionar más contraste, es útil maniobrar las luces de cuello de cisne para que queden paralelas a la mesa de trabajo.
- Retire el soporte de montaje adicional del portaobjetos con una pipeta, teniendo cuidado de no pipetear los cerebros del portaobjetos.
- Absorba los medios de montaje adicionales. Esto permitirá que los cerebros se posicionen con mayor precisión durante el siguiente paso.
- Usando un par de pinzas y el microscopio estereoscópico, coloque los cerebros en el portaobjetos en un patrón de cuadrícula con los lóbulos de las antenas hacia arriba.
- Coloque un cubreobjetos (el "puente") sobre el cerebro (Figura 1A). Use esmalte de uñas para sellar los lados del deslizamiento de la cubierta del puente donde entran en contacto con los deslizamientos de la cubierta de la "base".
- Con una pipeta p200, llene lentamente la cavidad central debajo del puente con medios de montaje nuevos (Figura 1B). Coloque una gota a la vez en el borde abierto del cubreobjetos central y permita que el medio de montaje se absorba debajo del cubreobjetos del puente central. Continúe hasta que toda la cavidad esté llena con medios de montaje, luego selle la parte superior e inferior con esmalte de uñas transparente.
- Una vez que el esmalte de uñas esté seco, tome una imagen de las diapositivas inmediatamente o guárdelas en una caja hermética resistente a la luz a -20 ° C.
- En el plazo de una semana, se obtienen imágenes del cerebro utilizando un microscopio confocal de barrido láser con láseres de excitación y cubos de filtro adecuados para los anticuerpos secundarios fluorescentes elegidos. Las imágenes de pila Z de las neuronas del cuerpo de los hongos generalmente se obtienen usando objetivos de 20X o 40X.
