1. Preparación para la microinyección
- Prepárese para la inyección extrayendo capilares de vidrio con un extractor de micropipetas (consulte la Tabla de materiales), siguiendo el protocolo de cinco pasos para la extracción de tubos capilares de vidrio (Tabla 1).
- Abra la punta de la aguja (capilares de vidrio de pared delgada [3,5 pulgadas] con filamento, diámetro exterior [OD] 1,14 mm) al tamaño apropiado en un ángulo con pinzas (Figura 1A).
- Llene la aguja con 0,1 ml de aceite mineral para asegurarse de que no queden burbujas.
- Retire el tapón de rosca de la aguja de acero del aparato de microinyección. Alinee el orificio de la aguja de vidrio con la aguja de acero y luego apriete el tapón de rosca. Monte el aparato de microinyección de aguja cargado en un micromanipulador (consulte la tabla de materiales).
- Ajuste la posición del aparato de microinyección para que el micromanipulador pueda mover el aparato de manera flexible bajo el microscopio. Descargue un cierto volumen de aceite de parafina para hacer que la aguja de acero ingrese al tubo de vidrio capilar.
- Deje caer la solución inyectable (como 1× solución salina tamponada con fosfato (PBS) o 5 mg/mL de LPS) en un portaobjetos de vidrio esterilizado con etanol al 70% y ajuste el aparato de microinyección para que la punta se inserte en la gota líquida. Cargue ~2 μL de solución inyectable en la aguja.
- Configure el micromanipulador (ajustes finos de arriba, abajo, izquierda y derecha) de modo que la punta de la aguja del aparato de microinyección esté en el mismo campo de visión que las larvas con un aumento alto (Figura 1B).
>2. Montaje de pez cebra para microinyecciones
NOTA: El desarrollo del cerebro del pez cebra ocurre dentro de los 3 días posteriores a la fertilización (dpf) y madura a los 5 dpf con un sistema nervioso central bien desarrollado. Por lo tanto, las larvas de 5 dpf ya son adecuadas para estudiar el daño neuronal mediado por LPS, así como las respuestas conductuales e inflamatorias.
- Inyecte las larvas de pez cebra dentro de aproximadamente 30 minutos de alcanzar la etapa de interés, para mantener la consistencia del tiempo de inyección.
- Para anestesiar las larvas de pez cebra, combine la tricaína con agua limpia de la pecera (concentración final de 0,02% p/v de tricaína).
- Derretir una solución de agarosa al 2% en agua bidestilada (ddH2O) utilizando un microondas. Vierte la agarosa fundida en un plato de plástico. El plato de plástico recubierto de agarosa al 2% puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Utilice una pipeta de transferencia de plástico para transportar las larvas anestesiadas al centro del plato de plástico recubierto de agarosa al 2%. Oriente las larvas montadas con el cerebro hacia arriba para acceder a la aguja.
>3. Inyectar el ventrículo cerebral
- Ajuste el aumento del microscopio para que la estructura ventricular del cerebro del pez cebra se muestre claramente en el campo de visión (Figura 1B).
- Coloque la aguja con cuidado sobre el tectum encefálico (Figura 1C).
- Perfore la piel del cerebro del pez cebra con la punta de la aguja lentamente usando el micromanipulador.
- Presione el pedal para expulsar 1 nL de 1x PBS o diferentes concentraciones de LPS (1.0, 2.5 y 5.0 mg/mL) (consulte la Tabla de materiales). A modo de ejemplo, se muestran imágenes exitosas de inyección de ventrículo en las que se inyectó el ventrículo cerebral con 1 nL de colorante azul de Evans al 1% (diluido en PBS) (Figura 1D). Transfiera las larvas a un medio de agua limpia para huevos (E3) inmediatamente después de la inyección. Después de 24 h, recoja las larvas para obtener imágenes microscópicas, realizar un ensayo de comportamiento locomotor y determinar otros indicadores.
