1. Preparación experimental
NOTA: Las siguientes soluciones madre pueden prepararse y mantenerse hasta su uso.
- Solución de disección
- Disuelva 3,62 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,2 g de cloruro de potasio (KCl), 0,069 g de fosfato de sodio (NaH2PO4 ∙ H2O) y 1,306 g de D-(+)-glucosa en 500 mL de H2O destilado. A continuación, añada 12,5 ml de tampón HEPES, 450 μL de solución de rojo de fenol y 20 ml de fracción V de albúmina sérica bovina (BSA) a la solución. Ajuste a pH 7.4 usando hidróxido de sodio (NaOH) 1 N.
- Esterilizar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C. Esta solución permanecerá estable durante un máximo de una semana a 10 días.
- tripsina
- Preparar una solución madre a una concentración de 25 g/L de tripsina en cloruro sódico al 0,9%. Almacene la solución a -20 °C.
- Inhibidor de tripsina
- Prepare un caldo con una concentración de 10 mg/ml disolviendo 1 g de inhibidor de la tripsina de la clara de huevo de gallina en 100 mL de HCl de 1 mM. Almacene esta solución a -20 °C.
- Desoxirribonucleasa (DNasa)
- Disuelva 100 mg de DNasa 1 en 10 mL de agua estéril para generar un stock de 10 mg/mL. Almacene la solución a -20 °C.
- MgSO4
- Añadir 6,02 g de sulfato de magnesio (MgSO4) a 50 mL de agua destilada (H2O) para generar un caldo de 1 M. Almacene la solución a 4 °C.
- CaCl2
- Disolver 0,735 g de cloruro de calcio (CaCl2∙ 2H2O) en 50 mL de H2O destilado hasta una concentración de caldo de 100 mM. Almacene la solución a 4 °C.
- Kcl
- Disolver 3,7275 g de KCl en 50 mL de H2O destilado hasta una concentración de 1 M. Almacenar la solución a 4 °C.
- D-(+)-Glucosa
- Disolver 1,802 g de D-(+)-glucosa en 50 mL deH2Odestilado hasta una concentración de 100 mM. Almacene la solución a 4 °C.
- Medios de cultivo celular
- Prepare los medios de cultivo celular de la siguiente manera: 5 mL de suero fetal bovino dializado inactivado por calor, 500 μL de 200 mM de L-glutamina, 100 μL de 50 mg/mL de gentamicina y 1 mL de 1.0 M KCL deben agregarse a 45 mL de medio esencial mínimo (E-MEM) esterilizado por filtro que se complementa con 1.125 g / L de D-glucosa para generar 50 mL de medio de cultivo de neuronas granulosas cerebelosas (CGN). Almacene los medios a 4 °C.
- Citosina Beta-D-Arabino Furanósido
- Disuelva 48 mg de furanósido de citosina beta-D-arabino en 10 mL de medio de crecimiento hasta una concentración de stock de 20 mM. Almacene la solución a -20 °C.
- Poli-D-lisina
- Para generar un caldo de poli D-lisina de 2 mg/mL, agregue 10 mL deH2Oestéril a 20 mg de poli D-lisina. El poli D-lisina en stock debe almacenarse a -80 °C en alícuotas de 100 μL.
nota: Las siguientes soluciones deben prepararse antes de la disección y mantenerse a 4 °C hasta su uso.
- MgSO4 Solución de disección suplementada
- Añadir 300 μL de MgSO4 a 250 mL de solución de disección.
- Solución de disección de tripsina
- Añadir 100 μL de tripsina madre y 12 μL de MgSO madre 4 a 10 mL de solución de disección.
- Solución 1 para inhibir la tripsina
- Añadir 164 μL de inhibidor de tripsina, 250 μL de DNasa 1 y 12 μL de MgSO,4 a 10 mL de solución de disección.
- Solución 2 de inhibidor de tripsina
- Añadir 1040 μL de inhibidor de tripsina, 750 μL de DNasa 1 y 12 μL de MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.
- Solución de disección suplementada con CaCl2
- Añadir 10 μL de caldo CaCl2 y 25 μL de caldo MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.
- Platos de cultivo recubiertos de poli D-lisina
- Para recubrir las placas de cultivo, diluir 100 μL de poli D-lisina en 40 mL de H2O estéril. Para placas de cultivo de Nunc de 35 mm, agregue 2 mL de solución diluida de poli D-lisina. Para placas de 4 pocillos, agregue 300 μL de poli D-lisina diluida a cada pocillo.
- Deje reposar la poli D-lisina durante 1 h antes de aspirar y lavar cada pocillo con 4 mL o 600 μL (para placas de cultivo de 35 mm o placas de 4 pocillos, respectivamente) de H2O estéril. A continuación, aspire el H2O y deje que la vajilla se seque al aire durante 1 h.
>2. Extracción cerebral y aislamiento del cerebelo
- Decapita a un cachorro de ratón de 6 a 7 días con unas tijeras de decapitación. Realizar la disección del cerebro en una campana de cultivo de tejidos estéril.
- Para extirpar el cerebro, agarre la cabeza con un par de pinzas y corte a través de la piel hacia la parte anterior de la cabeza con tijeras de microdisección, como se muestra en la Figura 1. A continuación, corte el hueso del cráneo con unas tijeras nuevas para minimizar el riesgo de contaminación. Retire el cráneo que cubre el cerebro con fórceps y extraiga el cerebro con fórceps o una espátula.
- Según sea necesario, corte a través del nervio óptico para facilitar la extracción del cerebro en su totalidad.
- Coloque el cerebro en la solución de disección, que se complementa con MgSO4. Mantén la solución y el cerebro en hielo.
- Después de la extracción del cerebro, bajo un microscopio de disección, diseccione el cerebelo del cerebro mientras aún está en la solución de disección suplementada con MgSO4 y retire las meninges con pinzas finas. Gire el cerebelo hacia su lado ventral y asegure la extirpación del plexo coroideo.
- Agrupe el cerebelo en un plato de 35 mm que contenga ~ 1 mL de solución de disección suplementada con MgSO4.
- Picar el tejido en pedazos pequeños y transferirlo a un tubo de 50 mL que contiene 30 mL de solución de disección tamponada con MgSO4.
>3. Aislamiento y cultivo de neuronas de gránulos cerebelosos de ratón
- Centrifugar el tubo de 50 ml que contiene el tejido cerebral picado durante 5 min a 644 x g y 4 °C.
- Retire el sobrenadante y agregue 10 mL de solución de disección de tripsina. A continuación, agite el tubo a alta velocidad durante 15 minutos a 37 °C.
- Agregue 10 ml de solución inhibidora de tripsina 1 al tubo y mueva suavemente durante 2 minutos.
- Centrifugar el tubo durante 5 min a 644 x g y 4 °C.
- Retire el sobrenadante y agregue 2 mL de solución 2 del inhibidor de tripsina, y luego transfiéralo a un tubo de 15 mL.
- Triture el tejido en el tubo de 15 ml hasta que la solución se vuelva turbia. Luego deje reposar durante 5 minutos.
- Retire el sobrenadante transparente y transfiéralo a un nuevo tubo que contenga 1 ml de solución de disección suplementada con CaCl2.
- Agregue otro mL de solución 2 del inhibidor de tripsina al fondo del tubo que contiene el pellet del paso 3.6. Trituramos de nuevo y dejamos reposar durante 5 min. Retire el sobrenadante y agréguelo al tubo que contiene el sobrenadante del paso 3.7 (es una repetición de los pasos 3.6-3.7). Repita este proceso hasta que la mayor parte del tejido se disocie mecánicamente.
- Agregue 0,3 mL de solución de disección suplementada con CaCl2 a la colección de sobrenadante por cada mL de sobrenadante.
- Mezcle el contenido del tubo y luego centrifugue durante 5 min a 644 x g.
- Retire el sobrenadante y agregue 10 mL de medio fresco al pellet y mezcle.
- A continuación, se pueden contar las células y diluirlas hasta una concentración de 1,5 x 106 células/mL. Tenga en cuenta que, en general, se esperan 10 millones de células de cada cerebro disecado, dependiendo del tiempo de tripsinización y la eficiencia de la disección. Celdas de placa en placas de poli D-lisina previamente fabricadas. Para placas de 4 pocillos, placa de 0,5 mL, lo que da 7,5 x 105 celdas por pocillo. Para platos de 35 mm, coloque 4 mL, dando 6 x 106 celdas por plato.
- Pasadas las 24 h, añadir furanósido de citosina-β-arabino (AraC) a las placas para reducir la contaminación glial. Por cada mL de medio se requieren 0,5 μL de 20 mM de AraC. La adición de AraC no requiere un cambio de medio. Si las células se van a mantener durante 7-8 días, repita este tratamiento el día 3.
- Mantener los cultivos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y alimentar con 100 μL de 100 mM de glucosa añadida al cultivo por cada 2 mL de medio cada 2 días durante los últimos 5 días. No se requiere un cambio completo de medios.
>4. Modelando la lesión neuronal
- Para inducir la muerte celular inducida por ROS (estrés oxidativo), trate las neuronas con peróxido de hidrógeno (H2O2) de 75-100 μM y cambie a medios acondicionados de cultivos paralelos después de una exposición de 5 minutos aH2O2. Tenga en cuenta que, debido a la inestabilidad deH2O2, optimice la concentración a un nivel que induzca la muerte celular en cultivo en un 50-70% después de 24 h de tratamiento (Figura 2).
