Modelado de la muerte neuronal inducida por especies reactivas de oxígeno en neuronas granulosas cerebelosas de ratón

1. Preparación experimental

NOTA: Las siguientes soluciones madre pueden prepararse y mantenerse hasta su uso.

1. Solución de disección
   1. Disuelva 3,62 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,2 g de cloruro de potasio (KCl), 0,069 g de fosfato de sodio (NaH₂PO₄ ∙ H₂O) y 1,306 g de D-(+)-glucosa en 500 mL de H₂O destilado. A continuación, añada 12,5 ml de tampón HEPES, 450 μL de solución de rojo de fenol y 20 ml de fracción V de albúmina sérica bovina (BSA) a la solución. Ajuste a pH 7.4 usando hidróxido de sodio (NaOH) 1 N.
   2. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C. Esta solución permanecerá estable durante un máximo de una semana a 10 días.
2. tripsina
   1. Preparar una solución madre a una concentración de 25 g/L de tripsina en cloruro sódico al 0,9%. Almacene la solución a -20 °C.
3. Inhibidor de tripsina
   1. Prepare un caldo con una concentración de 10 mg/ml disolviendo 1 g de inhibidor de la tripsina de la clara de huevo de gallina en 100 mL de HCl de 1 mM. Almacene esta solución a -20 °C.
4. Desoxirribonucleasa (DNasa)
   1. Disuelva 100 mg de DNasa 1 en 10 mL de agua estéril para generar un stock de 10 mg/mL. Almacene la solución a -20 °C.
5. MgSO₄
   1. Añadir 6,02 g de sulfato de magnesio (MgSO₄) a 50 mL de agua destilada (H₂O) para generar un caldo de 1 M. Almacene la solución a 4 °C.
6. CaCl₂
   1. Disolver 0,735 g de cloruro de calcio (CaCl₂∙ 2H₂O) en 50 mL de H₂O destilado hasta una concentración de caldo de 100 mM. Almacene la solución a 4 °C.
7. Kcl
   1. Disolver 3,7275 g de KCl en 50 mL de H₂O destilado hasta una concentración de 1 M. Almacenar la solución a 4 °C.
8. D-(+)-Glucosa
   1. Disolver 1,802 g de D-(+)-glucosa en 50 mL de_H2Odestilado hasta una concentración de 100 mM. Almacene la solución a 4 °C.
9. Medios de cultivo celular
   1. Prepare los medios de cultivo celular de la siguiente manera: 5 mL de suero fetal bovino dializado inactivado por calor, 500 μL de 200 mM de L-glutamina, 100 μL de 50 mg/mL de gentamicina y 1 mL de 1.0 M KCL deben agregarse a 45 mL de medio esencial mínimo (E-MEM) esterilizado por filtro que se complementa con 1.125 g / L de D-glucosa para generar 50 mL de medio de cultivo de neuronas granulosas cerebelosas (CGN). Almacene los medios a 4 °C.
10. Citosina Beta-D-Arabino Furanósido
    1. Disuelva 48 mg de furanósido de citosina beta-D-arabino en 10 mL de medio de crecimiento hasta una concentración de stock de 20 mM. Almacene la solución a -20 °C.
11. Poli-D-lisina
    1. Para generar un caldo de poli D-lisina de 2 mg/mL, agregue 10 mL de_H2Oestéril a 20 mg de poli D-lisina. El poli D-lisina en stock debe almacenarse a -80 °C en alícuotas de 100 μL.
       nota: Las siguientes soluciones deben prepararse antes de la disección y mantenerse a 4 °C hasta su uso.
12. MgSO₄ Solución de disección suplementada
    1. Añadir 300 μL de MgSO₄ a 250 mL de solución de disección.
13. Solución de disección de tripsina
    1. Añadir 100 μL de tripsina madre y 12 μL de MgSO madre 4 a 10 mL de solución de disección.
14. Solución 1 para inhibir la tripsina
    1. Añadir 164 μL de inhibidor de tripsina, 250 μL de DNasa 1 y 12 μL de MgSO,₄ a 10 mL de solución de disección.
15. Solución 2 de inhibidor de tripsina
    1. Añadir 1040 μL de inhibidor de tripsina, 750 μL de DNasa 1 y 12 μL de MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.
16. Solución de disección suplementada con CaCl₂
    1. Añadir 10 μL de caldo CaCl₂ y 25 μL de caldo MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.
17. Platos de cultivo recubiertos de poli D-lisina
    1. Para recubrir las placas de cultivo, diluir 100 μL de poli D-lisina en 40 mL de H₂O estéril. Para placas de cultivo de Nunc de 35 mm, agregue 2 mL de solución diluida de poli D-lisina. Para placas de 4 pocillos, agregue 300 μL de poli D-lisina diluida a cada pocillo.
    2. Deje reposar la poli D-lisina durante 1 h antes de aspirar y lavar cada pocillo con 4 mL o 600 μL (para placas de cultivo de 35 mm o placas de 4 pocillos, respectivamente) de H₂O estéril. A continuación, aspire el H₂O y deje que la vajilla se seque al aire durante 1 h.

>2. Extracción cerebral y aislamiento del cerebelo

1. Decapita a un cachorro de ratón de 6 a 7 días con unas tijeras de decapitación. Realizar la disección del cerebro en una campana de cultivo de tejidos estéril.
2. Para extirpar el cerebro, agarre la cabeza con un par de pinzas y corte a través de la piel hacia la parte anterior de la cabeza con tijeras de microdisección, como se muestra en la Figura 1. A continuación, corte el hueso del cráneo con unas tijeras nuevas para minimizar el riesgo de contaminación. Retire el cráneo que cubre el cerebro con fórceps y extraiga el cerebro con fórceps o una espátula.
   1. Según sea necesario, corte a través del nervio óptico para facilitar la extracción del cerebro en su totalidad.
3. Coloque el cerebro en la solución de disección, que se complementa con MgSO₄. Mantén la solución y el cerebro en hielo.
4. Después de la extracción del cerebro, bajo un microscopio de disección, diseccione el cerebelo del cerebro mientras aún está en la solución de disección suplementada con MgSO₄ y retire las meninges con pinzas finas. Gire el cerebelo hacia su lado ventral y asegure la extirpación del plexo coroideo.
5. Agrupe el cerebelo en un plato de 35 mm que contenga ~ 1 mL de solución de disección suplementada con MgSO₄.
6. Picar el tejido en pedazos pequeños y transferirlo a un tubo de 50 mL que contiene 30 mL de solución de disección tamponada con MgSO₄.

>3. Aislamiento y cultivo de neuronas de gránulos cerebelosos de ratón

1. Centrifugar el tubo de 50 ml que contiene el tejido cerebral picado durante 5 min a 644 x g y 4 °C.
2. Retire el sobrenadante y agregue 10 mL de solución de disección de tripsina. A continuación, agite el tubo a alta velocidad durante 15 minutos a 37 °C.
3. Agregue 10 ml de solución inhibidora de tripsina 1 al tubo y mueva suavemente durante 2 minutos.
4. Centrifugar el tubo durante 5 min a 644 x g y 4 °C.
5. Retire el sobrenadante y agregue 2 mL de solución 2 del inhibidor de tripsina, y luego transfiéralo a un tubo de 15 mL.
6. Triture el tejido en el tubo de 15 ml hasta que la solución se vuelva turbia. Luego deje reposar durante 5 minutos.
7. Retire el sobrenadante transparente y transfiéralo a un nuevo tubo que contenga 1 ml de solución de disección suplementada con CaCl₂.
8. Agregue otro mL de solución 2 del inhibidor de tripsina al fondo del tubo que contiene el pellet del paso 3.6. Trituramos de nuevo y dejamos reposar durante 5 min. Retire el sobrenadante y agréguelo al tubo que contiene el sobrenadante del paso 3.7 (es una repetición de los pasos 3.6-3.7). Repita este proceso hasta que la mayor parte del tejido se disocie mecánicamente.
9. Agregue 0,3 mL de solución de disección suplementada con CaCl₂ a la colección de sobrenadante por cada mL de sobrenadante.
10. Mezcle el contenido del tubo y luego centrifugue durante 5 min a 644 x g.
11. Retire el sobrenadante y agregue 10 mL de medio fresco al pellet y mezcle.
12. A continuación, se pueden contar las células y diluirlas hasta una concentración de 1,5 x 10⁶ células/mL. Tenga en cuenta que, en general, se esperan 10 millones de células de cada cerebro disecado, dependiendo del tiempo de tripsinización y la eficiencia de la disección. Celdas de placa en placas de poli D-lisina previamente fabricadas. Para placas de 4 pocillos, placa de 0,5 mL, lo que da 7,5 x 10⁵ celdas por pocillo. Para platos de 35 mm, coloque 4 mL, dando 6 x 10⁶ celdas por plato.
13. Pasadas las 24 h, añadir furanósido de citosina-β-arabino (AraC) a las placas para reducir la contaminación glial. Por cada mL de medio se requieren 0,5 μL de 20 mM de AraC. La adición de AraC no requiere un cambio de medio. Si las células se van a mantener durante 7-8 días, repita este tratamiento el día 3.
14. Mantener los cultivos en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C y alimentar con 100 μL de 100 mM de glucosa añadida al cultivo por cada 2 mL de medio cada 2 días durante los últimos 5 días. No se requiere un cambio completo de medios.

>4. Modelando la lesión neuronal

1. Para inducir la muerte celular inducida por ROS (estrés oxidativo), trate las neuronas con peróxido de hidrógeno (_H2O2) de 75-100 μM y cambie a medios acondicionados de cultivos paralelos después de una exposición de 5 minutos a_H2O2. Tenga en cuenta que, debido a la inestabilidad de_H2O₂, optimice la concentración a un nivel que induzca la muerte celular en cultivo en un 50-70% después de 24 h de tratamiento (Figura 2).

Figura 1: Extracción del cerebro de ratón y disección del cerebelo. (A) Para extraer el cerebro de un ratón de 6-7 días de edad, usando un par de pinzas, agarre la cabeza y corte la piel anteriormente a lo largo de las líneas punteadas usando un par de tijeras de microdisección. Tenga cuidado de cortar solo la piel y el tejido conectivo, una incisión demasiado profunda puede perforar el cráneo y dañar el cerebro. Estas tres incisiones, rectas a lo largo de la línea media y dos curvadas lateralmente, permiten empujar la piel hacia atrás revelando el cráneo. Una vez expuesto, el cráneo puede ser penetrado con la punta de las tijeras, y cortado anteriormente. Se debe tener mucho cuidado de no dañar el cerebelo para facilitar la identificación y eliminación de las meninges. Una vez cortado, se pueden usar fórceps para despegar el cráneo, exponiendo el cerebro, que luego se puede extraer en una solución de disección fría con un par de pinzas o una espátula. Para extirpar el cerebro, es posible que sea necesario cortar el nervio óptico. (B) Una vez extraídas del cráneo, las meninges deben extraerse del cerebelo utilizando un par de pinzas de punta fina. (C) Usando un par de pinzas de punta fina, el cerebelo se disecciona del tejido restante y se inspecciona para asegurar la extirpación completa de las meninges.

Figura 2: Modelado de la lesión neuronal en neuronas granulosas cerebelosas. Los ratones cerebelosos aislados del día 6-7 se disocian en células individuales siguiendo el procedimiento presentado en la parte 3. Después de la disociación, las células se cuentan y se resuspenden en un volumen de medio de cultivo para generar 1,5 x 106 células/mL. Para placas de 35 mm, se colocan 4 mL, lo que da 6 x 106 células por placa. Para los portaobjetos de imagen, se platean 0,5 mL, lo que da 7,5 x 105 células/pocillo. Los CGN pueden ser transducidos con lentivirus o infectados con adenovirus. El uso de adenovirus el día de la siembra (0 días in vitro (DIV)) proporciona una eficiencia de transfección superior al 90% y permite el estudio de la lesión neuronal a través del estrés oxidativo y el daño del ADN. La adición de 10 μM de camptotecina (CPT) inducirá daño en el ADN, mientras que 75-100 μM de peróxido de hidrógeno (H2O2) inducirá estrés oxidativo. La concentración deH2O2 debe optimizarse para inducir el 50% de la muerte celular después de 24 h. La infección con adenovirus a 5 DIV proporciona una eficiencia de transducción más baja de menos del 10%. A 7 DIV, cuando los receptores NMDA se enriquecen en el cultivo, las neuronas se pueden tratar con 100 μM de NMDA y 10 μM de glicina para inducir excitotoxicidad. Esto es ideal para el análisis de imágenes posteriores o el rastreo de una sola neurona. Por último, la transducción con lentivirus a 0 DIV, seguida de un tratamiento con 100 μM de NMDA y 10 μM de glicina a 7 DIV, proporciona una eficiencia de transducción suficientemente alta (>80%) para permitir el análisis bioquímico del cultivo, incluida la secuenciación de ChIP, el examen de la expresión de proteínas y la realización de ensayos vivos/muertos.