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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Inmunohistoquímica
- Tinción con análogos de timidina
- Coloque las secciones de tejido en PBS (solución salina tamponada con fosfato) y monte de 5 a 8 secciones en un portaobjetos cargado positivamente, manteniendo el orden en serie de anterior a posterior y la misma orientación. Deje que las secciones de tejido se sequen para que se adhieran completamente a los portaobjetos y luego dibuje un borde con un bolígrafo hidrofóbico o un bolígrafo PAP.
- Permeabilizar las secciones con tampón de permeabilización (0,5% TBS (solución salina tamponada tris) -triton) durante 20-30 min. A continuación, lave las secciones 2 veces con TBS-triton durante 5 minutos cada una.
NOTA: La permeabilización ayuda a la penetración intracelular de los anticuerpos. El tiempo de permeabilización se puede ajustar en función del grosor del tejido y de la eficacia del anticuerpo. Alternativamente, se puede aumentar la concentración de detergente para aumentar la potencia de permeabilidad. Sin embargo, se debe tener cuidado de no permeabilizar durante demasiado tiempo, ya que la fragilidad de los tejidos aumenta con el tiempo de permeabilización prolongado.
- Prepare la solución de reacción de Edu (5-etinil-2'-desoxiuridina) de acuerdo con la Tabla 1. La concentración final de Alexa488-azida es de 15 μM en 1 mL de solución de reacción Edu.
- Incubar las secciones en la solución de reacción Edu durante 30 min a 1 h y luego lavar 3 veces en TBS-triton durante 5 min cada una. Después de este paso, cubra los portaobjetos con papel de aluminio para protegerlos de la luz. En esta etapa, verifique si la reacción de Edu funciona mediante el uso de un microscopio fluorescente. Las células marcadas con edu emitirán fluorescencia bajo un microscopio de epifluorescencia.
- Protocolo de sección de tejido montado
- Bloquee las secciones de tejido montadas en un portaobjetos del paso 1.1.4 utilizando un tampón de bloqueo criado en los mismos animales que el anticuerpo secundario, por ejemplo, suero de burro, durante 30 min a 1 h y luego lave 2 veces en TBS-triton durante 5 min cada una.
- Prepare la solución de anticuerpos primarios (es decir, anti-nestina de pollo) durante la etapa de bloqueo mezclando los anticuerpos primarios en una solución tampón de bloqueo a 1:200. 250 μL por portaobjetos es suficiente para asegurar que el tejido esté completamente sumergido en la solución.
- Incubar secciones de tejido en una solución primaria de anticuerpos durante la noche en RT después de los lavados de bloqueo. Modifique este paso en función del anticuerpo primario utilizado.
nota: Si los anticuerpos tienen un fondo alto o una unión inespecífica, la incubación a 4 °C en lugar de RT (temperatura ambiente) puede mejorar los resultados. Los anticuerpos con mala penetración en los tejidos se pueden dejar incubar durante 2 días si es necesario.
- Incubar secciones de tejido 3 veces en TBS-triton durante 5 minutos para eliminar el exceso de anticuerpos primarios. A continuación, incubar secciones de tejido en anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos (p. ej., Alexa 647 anti-pollo a 1:200) preparados en una solución tampón bloqueante durante 2 h a RT.
- Incubar secciones de tejido 3 veces en TBS-triton durante 5 min para eliminar el exceso de anticuerpo secundario y aplicar 300 μM de solución de DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) a 1:100 en PBS durante 15 min en RT.
- Incube secciones de tejido 3 veces en PBS durante 5 minutos para eliminar el exceso de DAPI y retire el círculo de la pluma de Papanicolaou alrededor del pañuelo con un hisopo de algodón o una toallita delicada. Deje que las secciones se sequen y luego aplique los medios de montaje y el cubreobjetos. Deje que el soporte de montaje se seque antes de obtener imágenes de las diapositivas.
Tabla 1: Soluciones utilizadas para la inmunohistoquímica
| Solución anticongelante | Etilenglicol 150 mL + sacarosa 150 g + llenado hasta 500 mL 0,1 M PB para solución de 500 mL |
| Tampón de citrato | 9 mL de caldo de ácido cítrico + 41 mL de tampón de citrato trisódico + 450 mL de ddH2O |
| Caldo de ácido cítrico | [0.1 M] Ácido cítrico 21 g/1 L ddH2O |
| Caldo de citrato trisódico | [0,1 M] Citrato trisódico 29,4 g/1 L ddH2O |
| Solución salina tamponada Tris -Triton (TBS -Triton) | 0.05% 100-x Triton en TBS |
| Tampón de permeabilización | 0.5% 100-x Triton en TBS |
| Búfer de bloqueo | 0,33 mL de suero de burro en 10 mL TBS-Triton |
| Solución Edu Reaction | Prepare una solución de CuSO 4,5H2O añadiendo 1 mg de CuSO 4,5H 2O en una solución de 4 ml de [0,1 M] Tris pH 8,5. A continuación, añada 1:40 de una solución de 600 μM de Alexa488-azida y 10 mg/mL de ascorbato L-Na+ a la solución de CuSO4·5H2O antes de aplicarla sobre el tejido. |