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>1. Mantenimiento del cultivo de células microgliales
- Medio de cultivo celular caliente (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina/neomicina (PSN) a 37 °C.
- Obtener un stock congelado de células microgliales BV2 en el paso 18 - 25 del almacenamiento a -80 °C. Descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C.
- Transfiera suavemente las células a un matraz ventilado de 75cm2 que contenga 10 ml de medios de cultivo celular.
- Incubar el matraz en CO2 al 5% a 37 °C. Aspirar el medio después de 24 horas y sustituirlo por medio nuevo. Cultive células hasta aproximadamente 70 - 80% de confluencia.
>2. Conteo y enchapado de celdas
- En un baño de agua a 37 °C, calentar una solución de DMEM y 1x-tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA).
- Aspirar los medios de las células y añadir 500 μl de tripsina. Incubar a 37°C durante 2 - 5 min.
- Con un raspador, retire las células del matraz y suspenda en 5 ml de DMEM. Pase las células a través de un colador de 70 μm a un tubo de 50 ml tres veces.
- Cuente las células con un hemocitómetro y siembre 8.000 células/pocillo en una placa inferior transparente de paredes negras con un volumen final de 200 μl de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN. Placa de incubación en 5% CO2 a 37 °C durante 24 horas.
- Retire el DMEM viejo y reemplácelo con 200 μl de DMEM calentado suplementado con PSN al 1% para la microglía sérica hambrienta. Placa de incubación en 5% CO2 a 37 °C durante 24 horas.
>3. Activación de la microglía
- En tubos separados, diluir nanopartículas de plata (AgNPs) (0,01, 0,05 o 0,1 μg/ml) y control vehículo/neutro (citrato de sodio, 0,04 mM) en DMEM sin suero suplementado con PSN al 1% hasta las concentraciones finales de trabajo.
- Retire 100 μl de medio de cada pocillo y reemplácelo con 100 μl de compuesto de tratamiento adecuado.
- Placa de incubación en 5 % de CO2 a 37 °C durante 24 horas.
>4. Filtrado de medios condicionados
- Recoja 200 μl de sobrenadante de cada pocillo y transfiéralo a un filtro (corte de peso molecular de 10 kDa) con tubo de recolección (capacidad de 1,5 a 2 ml).
- Centrifugar a 14.000 x g a temperatura ambiente durante 15 min.
- Deseche el flujo (sobrenadante con partículas) y coloque el filtro boca abajo en un nuevo tubo de recolección.
- Centrífuga a 1.000 x g a temperatura ambiente durante 2 min.
nota: El medio filtrado resultante (que contiene citocinas secretadas) se concentra seis veces.
- Lleve el volumen del concentrado a 400 μl con DMEM fresco suplementado con un 10% de FBS y un 1% de PSN y almacene en hielo.
>5. Mantenimiento del cultivo de células hipotalámicas
- Medio de cultivo celular DMEM tibio suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN a 37 °C.
- Obtener un stock congelado de células hipotalámicas (mHypo-A1/2) en el pasaje 18 - 25 almacenadas a 80 °C. Descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C.
- Transfiera suavemente las células a un matraz ventilado de 75cm2 que contenga 10 ml de medios de cultivo celular.
- Incubar el matraz en CO2 al 5% a 37 °C. Aspirar el medio después de 24 horas y sustituirlo por medio nuevo. Cultive las células hasta que estén aproximadamente al 70 - 80% de confluencia.
>6. Determinación de la toxicidad de las células hipotalámicas
- Calentar la solución de DMEM y 1x-tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 °C.
- Aspirar los medios de las células hipotalámicas y añadir 500 μl de tripsina. Incubar a 37 °C durante 2 - 5 min. Retire las células del matraz con un raspador, como se describe anteriormente en el paso 2.
- Contar las células con un hemocitómetro y placas de células hipotalámicas a 5.000 células/pocillo en una placa inferior transparente de paredes negras en un volumen final de 200 μl de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN, e incubar durante la noche en 5% de CO2 a 37 °C.
- Retire 100 μl de medios antiguos con una pipeta multicanal y agregue 100 μl de medios acondicionados concentrados filtrados hasta una concentración final de 1x.
- Placa de incubación en 5% CO2 a 37 °C durante 24 horas.
- Añadir 22 μl de reactivo de resazurina y fermentar la placa durante 20 min en CO2 al 5% a 37 °C.
- Utilizando un espectrofotómetro multimodo, registre la fluorescencia (560 nm EX/590 nm EM) para medir la viabilidad de la célula. Informe los resultados como unidades de fluorescencia relativa (RFU).