>1. Preparación de reactivos y equipos
- Prepare 1 tampón de disección (70 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,02 mM de CaCl2, 20 mM de MgCl2, 10 mM de NaHCO3, 115 mM de sacarosa, 5 mM de trehalosa, 5 mM de hidroxietilpiperazina, ácido etano sulfónico [HEPES]; pH 7,2).
- Prepare 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Prepare 1x PBT usando 1x PBS con 0.01% Triton X-100.
- Prepare placas de agar de jugo de frutas.14 Brevemente, mezcle 30 g de agar en 700 mL de H2O y autoclave. Disuelva 0,5 g de metilparabeno en 10 mL de etanol y agregue la solución a 300 mL de concentrado de jugo de fruta (uva o manzana). Mezcle el concentrado en una solución de agar esterilizada en autoclave y vierta en las tapas de las placas de Petri de 10 mm x 35 mm.
nota: La premezcla de poder de agar uva también se puede comprar en varias empresas (consulte la tabla de materiales).
- Obtener pinzas de tamaño 5 que permitan lesionar mecánicamente a las larvas.
- Utilice un aparato de anestesia estándar basado en Drosophila CO2.
>2. Selección de larvas de Drosophila
- Tome un vial o frasco de Drosophila que contenga larvas errantes de tercer estadio que hayan sido cultivadas a 25 °C.
- Seleccione diez larvas individuales de 2º o 3º estadio en función de su apariencia. Las larvas del tercer estadio se pueden identificar por la apariencia de espiráculos ramificados anteriores, mientras que las larvas del segundo estadio son más pequeñas y tienen espiráculos anteriores más en forma de maza
nota: Las etapas larvales también se pueden identificar por el tiempo. A 25 °C, las larvas del segundo estadio aparecen aproximadamente 48 h después de la eclosión, y las larvas del tercer estadio mudan aproximadamente 24 h después. Si está interesado en examinar la neurodegeneración en el NMJ, las larvas del segundo estadio deben lesionarse.
>3. Preparación de larvas de Drosophila para lesiones mecánicas
- Recoja cuidadosamente las larvas individuales con pinzas o un pincel, teniendo cuidado de no comprimirlas de ninguna manera.
- Coloque directamente diez larvas en un plato de vidrio que contenga 1X PBS frío o tampón de disección para eliminar cualquier residuo de comida y desacelerar la motilidad de las larvas.
>4. Lesiones mecánicas y tratamiento de larvas de Drosophila
- Coloque cada larva individual en un aparato anestésico de CO2.
- Bajo un microscopio de disección, enrolle cuidadosamente cada larva sobre su lado dorsal para visualizar los nervios segmentarios a través de la cutícula.
- Coloque las pinzas de tamaño 5 aproximadamente de 1/2 a 2/3 de la longitud de la larva, comenzando en los ganchos de la boca. Una vez colocado, pellizque aproximadamente 1/3 de la cutícula ventral que contiene los nervios segmentarios con pinzas de tamaño 5.
- Para asegurarse de que los nervios segmentarios de las larvas se lesionen, aplique suficiente fuerza para aplastar los nervios segmentarios, pero deje la cutícula intacta. Para determinar la cantidad correcta de fuerza, triture 10 larvas y asegúrese de que la tasa de mortalidad después de 5 h sea inferior al 50%.
- Después de la lesión, transfiera con cuidado las larvas a una placa de agar de jugo de frutas que contenga aproximadamente 0,5 g de pasta de levadura. Coloque cada larva de modo que su extremo anterior esté sobre la pasta de levadura, para continuar alimentándose a pesar de la motilidad interrumpida.
nota: Para asegurarse de que los nervios segmentarios de las larvas se han lesionado, se puede observar una motilidad larvaria interrumpida después de la transferencia a la placa de agar. Las larvas lesionadas quedan efectivamente paralizadas posteriores al sitio de la lesión, pero aún pueden mover sus ganchos bucales y alimentarse. Es común una alta tasa de mortalidad de animales después de lesiones, por lo que es mejor herir entre un 20 y un 50% más de animales de los necesarios para un experimento.
- Coloque placas de agar que contengan pasta de levadura y 10 larvas heridas en el fondo de una placa de Petri vacía de 100 x 15 mm. Cubra esta placa de Petri, que ahora contiene las larvas lesionadas en una placa de agar con una toalla de papel húmeda, asegurándose de que la toalla de papel no toque las larvas o las placas de agar. Coloque esta placa de Petri en un recipiente hermético más grande, a temperatura ambiente (RT).
- Recupere las larvas para su disección después de los períodos especificados (6, 12 o 24 h) después de la lesión.
nota: Para examinar los efectos inmediatos de la lesión en el citoesqueleto axonal, las larvas se pueden diseccionar directamente después de la lesión. Para examinar los defectos de transporte axonal, las larvas se pueden diseccionar aproximadamente 6 h después de la lesión. Aproximadamente 12 h después de la lesión se puede observar una acumulación de proteínas ubiquitinadas, y 24 h después de la lesión, se puede observar la degeneración de las neuronas motoras en la NMJ.