Generación de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

Abstract

Fuente: Tietz, S. M. et al. Visualizando el deterioro de las barreras endotelial y glial de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental in vivo. J. Vis. Exp.(2019)

Este video muestra el método para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inyectando péptidos derivados de mielina con un adyuvante para activar las células T autorreactivas, que migran al cerebro. La toxina de la tos ferina se administra para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que estas células T y otras células inmunitarias ingresen al cerebro. Estas células inmunitarias causan desmielinización, lo que conduce a una transmisión nerviosa alterada y al desarrollo de EAE.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Inducción EAE

1. Anestesiar ratones C57BL/6 con isofluorano utilizando un sistema vaporizador. Para inducir la anestesia en ratones, exponga al ratón a un 4,5% de isofluorano en oxígeno en una pequeña cámara de incubación antes de transferir al ratón a una mascarilla con 2,1% de isofluorano. Utilice una unidad de anestesia equipada con una almohadilla térmica para evitar la hipotermia del ratón.
2. Fije el ratón anestesiado en una mano e inyecte primero 30 μL de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG)-péptido aa_35-55 (MOG_35-55)/emulsión completa de adyuvante de Freund (CFA) por vía subcutánea en los flancos de las patas traseras (Figura 1: 1 + 2; en total 60 μL; flanco izquierdo 30 μL y flanco derecho 30 μL) muy cerca de los ganglios linfáticos inguinales.
3. Coloque el ratón sobre su vientre e inyecte 20 μL de emulsión MOGaa_35-55/CFA en el tejido graso blando izquierdo y derecho en la raíz de la cola (Figura 1: 3 + 4; en total 40 μL; raíz de la cola del lado izquierdo 20 μL y raíz de la cola del lado derecho 20 μL) y una pequeña gota de emulsión MOGaa_35-55/CFA en el cuello del ratón (Figura 1: 5).
4. Inyectar 100 μL de solución de toxina de tos ferina (PTx) por vía intraperitoneal en el ratón. Sostenga la cabeza del ratón por debajo del centro del cuerpo para evitar la inyección en el intestino.
5. Sustituir la dieta de mantenimiento (extruir los nutrientes principales: proteína bruta 18,5%; grasa bruta 4,5%; fibra bruta 4,5%; ceniza bruta 6,5%; almidón 35%; energía metabólica: 13,1 MJ/kg) por una dieta de cría (extruir nutrientes principales: proteína bruta 23,5%; grasa bruta 5,5%; fibra bruta 3%; ceniza bruta 5,7%; almidón 36%; energía metabólica: 14,3 MJ/kg) con el fin de proporcionar a los ratones alimentos de mayor contenido energético antes y durante la enfermedad clínica esperada.
6. Quítese la mascarilla y transfiera el ratón a su jaula doméstica con una almohadilla térmica. Después de 10 minutos, asegúrese de que el ratón esté completamente despierto y móvil.
7. Repita la inyección de PTx (paso 1.4) 48 horas después del primer tratamiento.

>2. Puntuación de ratones EAE

1. Comprueba cada mañana el estado de salud de los ratones EAE echando un vistazo al interior de las jaulas.
2. Puntúa ratones EAE todas las tardes.
3. Saca de la jaula a cada uno de los ratones incluidos en el experimento EAE y comprueba si la cola tiene tono moviéndola hacia arriba con un dedo. Un ratón sano mantendrá la cola levantada (la cola tiene un tono). Si se ha iniciado la EAE clínica, el tono de la cola será más bajo, visible por una caída gradual de la cola. Eventualmente, el ratón no podrá levantar la cola en absoluto.
4. Coloque cada uno de los ratones incluidos en el experimento EAE en el banco limpio y observe y documente el comportamiento al caminar. En la Tabla 1 se consultan los criterios de puntuación para la evaluación de la gravedad de la enfermedad (puntuación EAE).
5. Evalúe y documente el peso de cada ratón incluido en el experimento.
6. Para garantizar una ingesta adecuada de alimento y agua por parte de los ratones, con una puntuación clínica EAE de 1, suministre alimento humedecido en un plato de plástico en el fondo de la jaula y refrésquelo diariamente.

Results

Figura 1: Representación gráfica de los sitios de inyección para la inducción de EAE. 1) Sitio de inyección para 30 μL de emulsión de MOG en el flanco derecho, 2) Sitio de inyección para emulsión de MOG de 30 μL en el flanco izquierdo, 3) Sitio de inyección para emulsión de MOG de 20 μL en la raíz de la cola izquierda, 4) Sitio de inyección para emulsión de MOG de 30 μL en la raíz de la cola derecha,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alimento para la cría	p. ej., PROVIMI KLIBA SA	3336
Jaulas con ventilación individual, línea azul tipo II o III	. ej., Tecniplast	1145T, 1285L
Ratones hembra C57BL/6J (8-12 semanas)	p. ej., Janvier Labs		Hembras, 8-12 semanas
Aguja de inyección de 18G x 11/2'' (1,2 mm x 40 mm)	p. ej., BD, Microlance 3	304622
27G x 3/4'' – Nr. 20 (0,4 mm x 19 mm) aguja de inyección	p. ej., BD, Microlance 3	302200
Aguja de inyección de 30G x 1/2'' (0,3 mm x 13 mm)	p. ej., BD, Microlance 3	304000
Adyuvante de Freund incompleto (IFA)	por ejemplo, Santa Cruz Biotechnology	SC-24648	Almacenar a 4°C
Alimentos de mantenimiento	p. ej., PROVIMI KLIBA SA	3436
Péptido MOGaa35-55	p. ej., GenScript		Almacenar a -80 °C
Mycobacterium tuberculosis H37RA	p. ej., BD	231141	Almacenar a 4 °C
NaCl 0.9 %	B. Braun	3535789
Omnican 50 30G x 1/2''	B. Braun	9151125S
Toxina de la tos ferina	por ejemplo, List biological laboratories, Inc.	180	Almacenar a 4 °C
Tijera de puntada	F.S.T	Año 15012-12
Jeringa 1 ml	p. ej. PRIMO	62.1002
Jeringa 10 ml	p. ej., CODAN Medical ApS	05/2022