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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Ensayo de permeabilidad in vivo
- Preparación de soluciones:
- Para las soluciones madre de dextrano, disuelva 10 mg de Dextran Alexa Fluor 488 de 10 kDa, así como 3 kDa de Dextran Texas Red en 500 μL de solución de cloruro de sodio al 0,9% (20 mg/mL).
- Para la solución de trabajo de dextrano, justo antes de la inyección, pipetee 55 μL de solución madre de Dextrano Alexa Fluor 488 de 10 kDa (20 mg/mL) sobre un trozo de película de sellado y agregue 55 μL de solución madre de dextrano Texas Red de 3 kDa (20 mg/mL). Mezclar y recoger 100 μL en una jeringa fina desechable (concentración final 2 mg/100 μL).
- Para la solución madre de formaldehído al 10% (paraformaldehído o PFA), combine 10 g de polvo extra puro de PFA, 100 ml de PBS y 200 μl de hidróxido de sodio (NaOH) 1N en un vaso de precipitados de vidrio limpio y caliente hasta 56 °C con una precisión de 56 °C mediante agitación con un agitador magnético. Mantener a 56 °C durante 30 minutos hasta que el PFA se disuelva por completo. Enfríe a temperatura ambiente, ajuste el pH a 7.4 y filtre a través de un filtro de papel. Almacenar a una temperatura máxima de 20 °C. La solución madre se puede diluir aún más con solución salina tamponada con fosfato o PBS.
- Anestesiar brevemente ratones C57BL/6 sanos o ratones C57BL/6 que padecen encefalomielitis autoinmune experimental, o EAE con isoflurano (el ratón estará sedado durante aproximadamente 1 min). Utilice un sistema automatizado (los ratones se expondrán a un 4,5% de isoflurano en oxígeno en una cámara de inducción y luego se transferirán a una mascarilla con un 2,1% de isoflurano).
- Coloque el ratón anestesiado en posición lateral sobre la mesa y, a continuación, inyecte por vía intravenosa (por ejemplo, retroorbitalmente) 100 μL de trazadores fluorescentes en el ratón antes de que éste se despierte.
- Retire inmediatamente la mascarilla y asegúrese de que el ratón esté completamente despierto y móvil después de la breve anestesia. Deje que el marcador circule durante 15 minutos.