Determinación de la disrupción de la barrera hematoencefálica mediante colorantes fluorescentes en un modelo de ratón EAE

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Ensayo de permeabilidad in vivo

1. Preparación de soluciones:
   1. Para las soluciones madre de dextrano, disuelva 10 mg de Dextran Alexa Fluor 488 de 10 kDa, así como 3 kDa de Dextran Texas Red en 500 μL de solución de cloruro de sodio al 0,9% (20 mg/mL).
   2. Para la solución de trabajo de dextrano, justo antes de la inyección, pipetee 55 μL de solución madre de Dextrano Alexa Fluor 488 de 10 kDa (20 mg/mL) sobre un trozo de película de sellado y agregue 55 μL de solución madre de dextrano Texas Red de 3 kDa (20 mg/mL). Mezclar y recoger 100 μL en una jeringa fina desechable (concentración final 2 mg/100 μL).
   3. Para la solución madre de formaldehído al 10% (paraformaldehído o PFA), combine 10 g de polvo extra puro de PFA, 100 ml de PBS y 200 μl de hidróxido de sodio (NaOH) 1N en un vaso de precipitados de vidrio limpio y caliente hasta 56 °C con una precisión de 56 °C mediante agitación con un agitador magnético. Mantener a 56 °C durante 30 minutos hasta que el PFA se disuelva por completo. Enfríe a temperatura ambiente, ajuste el pH a 7.4 y filtre a través de un filtro de papel. Almacenar a una temperatura máxima de 20 °C. La solución madre se puede diluir aún más con solución salina tamponada con fosfato o PBS.
2. Anestesiar brevemente ratones C57BL/6 sanos o ratones C57BL/6 que padecen encefalomielitis autoinmune experimental, o EAE con isoflurano (el ratón estará sedado durante aproximadamente 1 min). Utilice un sistema automatizado (los ratones se expondrán a un 4,5% de isoflurano en oxígeno en una cámara de inducción y luego se transferirán a una mascarilla con un 2,1% de isoflurano).
3. Coloque el ratón anestesiado en posición lateral sobre la mesa y, a continuación, inyecte por vía intravenosa (por ejemplo, retroorbitalmente) 100 μL de trazadores fluorescentes en el ratón antes de que éste se despierte.
4. Retire inmediatamente la mascarilla y asegúrese de que el ratón esté completamente despierto y móvil después de la breve anestesia. Deje que el marcador circule durante 15 minutos.