Inmunotinción de tejidos craneofaciales de ratón

Resumen

Fuente: Yang, J., et al., Preparación de tejidos e inmunotinción de tejidos craneofaciales de ratón y hueso no descalcificado. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la tinción por inmunofluorescencia de criosecciones de tejidos craneofaciales embrionarios de ratón, utilizando microscopía de fluorescencia para evaluar la expresión de marcadores nucleares y determinar la proliferación celular y la actividad de señalización.

Protocolo

Texto del descargo de responsabilidad: Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Tinción de inmunofluorescencia

1. Saque los portaobjetos a -80 °C. Mantenga los portaobjetos a RT durante 1 h para secar las secciones al aire. Enjuague los portaobjetos en PBST al 0,1 % (éter de terc-octilfenilo de polietilenglicol al 0,1 % en PBS; consulte la tabla de materiales) tres veces durante 5 minutos cada una para lavar la OCT y permeabilizar las secciones.
2. Opcionalmente, realice la recuperación de antígenos (opcional).
   1. Precalentar el tampón de citrato (10 mM de citrato de sodio pH 6) en la placa de tinción con una vaporera o baño de agua a 95-100 °C. Sumerja los portaobjetos en el tampón de citrato e incube durante 10 min.
   2. Saque el plato de tinción de la vaporera o del baño de agua y enfríe los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 minutos o más15.
      nota: Como alternativa, utilice el tampón Tris-EDTA (10 mM de base Tris, 1 mM de EDTA, 0,05 % Tween 20, pH 9,0) o el tampón EDTA (1 mM de EDTA, 0,05 % de Tween 20, pH 8,0) para la recuperación de antígenos inducida por el calor. Use una olla a presión, un microondas o un baño de agua para la recuperación de antígenos inducida por el calor, además de la vaporera caliente. Otra alternativa es la recuperación de antígenos inducida por enzimas mediante tripsina o pepsina. Optimice la concentración y el tiempo de tratamiento de la recuperación enzimática para evitar dañar las secciones. Optimice el método de recuperación de antígenos para cada combinación de anticuerpo/antígeno.
3. Incubar cada portaobjetos con 200 μL de solución bloqueante (suero de burro al 5% diluido en PBST al 0,1%) a RT durante 30 min, luego retirar la solución bloqueante sin enjuagar.
4. Incubar cada portaobjetos con 100 μL de anticuerpo primario o anticuerpos diluidos en solución bloqueante durante 1 h a RT o O/N a 4 °C. Enjuagar los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 min cada una a RT.
5. Incubar cada portaobjetos con 100 μL de anticuerpo secundario diluido en solución bloqueante durante 1 h en RT. Enjuague los portaobjetos en PBS tres veces durante 10 minutos cada uno en RT. Proteja los portaobjetos de la luz.
6. Montar correderas.
   1. Agregue dos gotas de medio anti-decoloración con DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindol) en el portaobjetos. A continuación, cúbralo con un cubreobjetos.
   2. Almacenar a 4 °C en la oscuridad hasta que esté listo para la imagen.
      nota: Como alternativa, etiquete los núcleos con DAPI o colorante Hoechst 33324 diluido 1:2.000 en PBS en RT primero, luego móntelos con glicerol.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa fluor 488-cabra anti-Conejo anticuerpo secundario	Invitrogen	A-11034
Montaje antidecoloración con DAPI	Invitrogen	P36931
Albúmina sérica bovina	sigma	A2153
Cubreobjetos	Marca Fisher	12-545-E
Criostato	Leica	CM1850
EDTA	sigma	E6758
Microscopio de fluorescencia	Olimpo	BX51
Portaobjetos de microscopio	Marca Fisher	Teléfono 12-550-15
Compuesto OCT	Fisher Healthcare (en inglés)	23-730-571
Paraformaldehído (PFA)	sigma	P6148
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	sigma	P4417
Éter de polietilenglicol terc-octilfenilo	sigma	T9284	Tritón X-100
Anticuerpo anti-Ki67 de conejo	Tecnología de señalización celular	9129	Lote #:3; RRID:AB_2687446
Anticuerpo anti-pSmad1/5/9 de conejo	Tecnología de señalización celular	Año 13820	Lote #:3; RRID:AB_2493181
Citrato de sodio	sigma	1613859
Tris	sigma	10708976001