Visualización de las motilidades de las vesículas en las neuronas mediante imágenes de fluorescencia

Abstract

Fuente: Tsuruta, F., et al. Cuantificación de las motilidades del endosoma y el lisosoma en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes. J. Vis. Exp. (2017).

Este video demuestra cómo las vesículas neuronales se marcan con proteínas fluorescentes específicas para visualizar su movimiento. Primero, un plásmido que codifica para una proteína fluorescente se incuba con un agente de transfección y luego se introduce en un cultivo de neuronas. Posteriormente, se adquieren imágenes de las neuronas y se analizan para rastrear el movimiento de las vesículas.

Protocol

1. Imagen de la motilidad de las vesículas

1. Prepare los plásmidos que marcarán cada tipo de vesícula. Por ejemplo, use EGFP-Rab5 para endosomas tempranos, EGFP-Rab7 para endosomas tardíos, LAMP-EGFP para lisosomas y EGFP-LC3 para autofagosomas><. nota: Estos plásmidos están disponibles bajo pedido a tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Normalmente, se pueden transfectar neuronas in vitro (División o DIV) de 3 a 5 días con estos plásmidos utilizando reactivos de transfección.
2. Mezclar 4,0 μg de plásmidos con 200 μL de medio libre de suero mediante pipeteo. En un tubo aparte, diluir 8 μL de reactivo de transfección (ver Tabla de Materiales) en 200 μL de medio libre de suero. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
3. Mezcle la solución de plásmido y la solución regente de transfección en el paso 1.2 mediante pipeteo. Incubar durante 20 min en RT.
4. Añada medio sin suero y 400 μL de la solución de plásmido del paso 1.3 a cada placa con fondo de vidrio recubierta que contenga neuronas corticales y medio de cultivo cortical cerebral. Incubar las neuronas a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5% durante 30 min. Reemplace el medio con 2 mL de medio de cultivo cortical cerebral. Incubar las neuronas a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5% durante 1-2 días.
   nota: Prepare un medio de cultivo cortical cerebral que consista en medio basal de neuronas suplementado con 1x suplementos de B-27, 2 mM de L-glutamina y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
5. Después de 1 a 2 días de transfección, seleccione las células transfectadas para la adquisición de imágenes.
   nota: Las neuronas prematuras con menos de 7 DIV tienden a exhibir una motilidad dinámica de las vesículas. Seleccione neuronas que expresen moderadamente la sonda de fluorescencia porque no se pueden obtener imágenes claras cuando se selecciona una neurona altamente expresiva. Además, seleccione una forma neuronal típica, como las neuronas piramidales, que tienen axones largos y dendritas intrincadas, para facilitar la identificación del axón y las dendritas (consulte la figura 1A).
6. Adquisición de imágenes mediante un sistema de imágenes de lapso de tiempo: Para la obtención de imágenes, utilice un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) con lentes de objetivo 40X Plan Apo 0.95NA o 100X Plan Apo VC NA1.4. Controle la temperatura a 37 °C mediante un sistema de incubación. Adquiera imágenes neuronales a un fotograma/5 s durante un período de 100 s controlado por el software de adquisición de imágenes. Alternativamente, adquiera imágenes a intervalos más cortos y durante períodos de tiempo más largos, como a un fotograma cada 2 segundos durante un período de 300 segundos.
   nota: Hay una variedad de aplicaciones disponibles para tomar imágenes secuenciales, muchas de las cuales serían adecuadas para este método. Por lo tanto, no se recomienda ninguna aplicación en particular; En su lugar, cada investigador debe utilizar cualquier aplicación que esté disponible.

>2. Análisis de imágenes

1. Abra todas las imágenes secuenciales en el software ImageJ con Seguimiento manual.
   nota: Hasta la fecha, el seguimiento manual se ha utilizado ampliamente en experimentos de seguimiento. El seguimiento manual fue desarrollado por el Dr. Fabrice Cordelières. Las instrucciones escritas detalladas están disponibles en línea. Para el análisis, la calidad de los datos de imagen se mejora con un número suficiente de imágenes. Se recomienda utilizar más de 20 imágenes.
2. Para combinar las imágenes secuenciales, seleccione→ → . Clic.
3. Elija → ; aparecerá una ventana de seguimiento.
4. Haga clic en la casilla de verificación y defina los parámetros de seguimiento en la sección de parámetros.
   nota: Se pueden establecer varios parámetros, incluido el intervalo de tiempo, la calibración x / y, la calibración z, el tamaño del cuadrado de búsqueda para centrar, el tamaño del punto, el ancho de línea y el tamaño de la fuente. En este ensayo simplificado, se definieron tanto el intervalo de tiempo como la calibración x/y. En otras circunstancias experimentales, puede ser necesario definir también otros parámetros. Los parámetros utilizados aquí son los siguientes: es de 5 s y es de 0,26642 μm para una lente de objetivo 40X Plan Apo 0.95NA o de 0.10657 μm para una lente de objetivo 100X Plan Apo VC NA1.4.
5. Una vez definidos los parámetros, haga clic en para iniciar una nueva pista.
6. Después de determinar las vesículas de interés (por ejemplo, las vesículas indicadas por puntas de flecha azules y rojas en la Figura 1A (panel derecho)), haga clic en el centro de las señales en las imágenes secuenciales para registrar las coordenadas xy. Los resultados de las coordenadas xy, la distancia y la velocidad registradas se muestran en una nueva ventana.
   nota: En el caso de los lisosomas, a menudo se observan grandes señales fluorescentes brillantes (por ejemplo, Figura 1A (panel derecho), punta de flecha naranja) en las neuronas. Estas señales ocasionalmente exhiben vesículas acumuladas o várices patológicas, por lo que estas señales deben evitarse para cuantificar la motilidad.
7. Repita el paso 2.6 para recopilar las coordenadas xy de las vesículas de todas las imágenes secuenciales; después de seleccionar el punto de referencia, cada imagen avanza automáticamente a la imagen sucesiva.
8. Exporte estos datos a una nueva tabla (por ejemplo, una hoja de cálculo). Utilice el software adecuado para crear un gráfico adecuado (consulte la Tabla de Materiales).
   nota: Para analizar los datos, seleccione la columna, sume todos los valores de esta columna y muestre una distancia de motilidad como un gráfico de barras, como en la figura 1B. Además, repita este paso, calcule el promedio de la distancia total de motilidad y muéstrelo como un gráfico de barras, como en la Figura 1C. El software para crear un gráfico de barras y datos de forma de onda se muestra en la Tabla de Materiales.

Results

Figura 1: Motilidad de los lisosomas en dendritas neuronales. (A) Las neuronas corticales de ratón (4 DIV) se transfectaron con plásmido LAMP-EGFP durante 2 días. Esta imagen muestra la motilidad de las vesículas que contienen LAMP-EGFP en las dendritas. El recuadro muestra la imagen de lapso de tiempo de las vesículas positivas para LAMP-EGFP. La punta de flecha roja indica una vesícula en movimient...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medio neurobasal	Termo Fisher	21103-049
Opti-MEM	Termo Fisher	31985070	Medio libre de suero
Penicilina Streptmicina	Termo Fisher	15140122
L-Glutamina	Termo Fisher	25030081
Suplementos de B-27	Termo Fisher	17504044
Hidrobromuro de poli-D-lisina	sigma	P7280
poli-L-ornitina	sigma	P4957
Lipofectamina 2000	Termo Fisher	11668027	Reactivo de transfección
Polietileno "Max"	Policiencias	24765	Reactivo de transfección. Como alternativa a Lipofectamine2000, se dispone de polietileneimina de 0,1 mg/ml disuelta en agua esterilizada. Pero es de baja eficiencia y alta toxicidad.
BIOREVO BZ-9000	Clave	Na
Sistema de incubación INUG2-K13	Golpe de Tokay	Na
GraphPad Prism versión 6.0	Software GraphPad	Na
Excel versión 15	Microsoft	Na
ImagenJ versión 1.47	Na	Na