Visualización de las motilidades de las vesículas en las neuronas mediante imágenes de fluorescencia

En este artículo

Resumen

Fuente: Tsuruta, F., et al. Cuantificación de las motilidades del endosoma y el lisosoma en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes. J. Vis. Exp. (2017).

Este video demuestra cómo las vesículas neuronales se marcan con proteínas fluorescentes específicas para visualizar su movimiento. Primero, un plásmido que codifica para una proteína fluorescente se incuba con un agente de transfección y luego se introduce en un cultivo de neuronas. Posteriormente, se adquieren imágenes de las neuronas y se analizan para rastrear el movimiento de las vesículas.

Protocolo

1. Imagen de la motilidad de las vesículas

Prepare los plásmidos que marcarán cada tipo de vesícula. Por ejemplo, use EGFP-Rab5 para endosomas tempranos, EGFP-Rab7 para endosomas tardíos, LAMP-EGFP para lisosomas y EGFP-LC3 para autofagosomas><. nota: Estos plásmidos están disponibles bajo pedido a tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Normalmente, se pueden transfectar neuronas in vitro (División o DIV) de 3 a 5 días con estos plásmidos utilizando reactivos de transfección.
Mezclar 4,0 μg de plásmidos con 200 μL de medio libre de suero mediante pipeteo. En un tubo aparte, diluir 8 μL de reactivo de transfección ....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

figure-results-1
Figura 1: Motilidad de los lisosomas en dendritas neuronales. (A) Las neuronas corticales de ratón (4 DIV) se transfectaron con plásmido LAMP-EGFP durante 2 días. Esta imagen muestra la motilidad de las vesículas que contienen LAMP-EGFP en las dendritas. El recuadro muestra la imagen de lapso de tiempo de las vesículas positivas para LAMP-EGFP. La punta de flecha roja indica una vesícula en movimient.......