Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Inmunofluorescencia
- Prepare soluciones que incluyan el tampón de bloqueo, el tampón de anticuerpos, el tampón de lavado 1 y el tampón de lavado 2 (ver Tabla 1).
- Enjuague las rodajas una vez con tampón de fosfato (PB) para eliminar el exceso de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT).
- Retire la solución con una pipeta de plástico sin succionar las rodajas de cerebro. Añadir 250 μL de PB fresco con una pipeta de 1000 μL.
cautela: Las rodajas no deben secarse, así que retírelas y agregue los líquidos pozo por pocillo.
- Retire el PB con una pipeta de plástico y añada 250 μL de tampón de bloqueo por pocillo con una pipeta de 1000 μL. Incubar durante 3 h a temperatura ambiente (RT) en el agitador.
- Durante el tiempo de incubación, diluya los anticuerpos primarios en tampón de anticuerpos en un tubo de reacción. Utilice 250 μL de tampón de anticuerpos por pocillo y añada la cantidad adecuada de anticuerpo (ver Tabla 2) pipeteándolo directamente en la solución con una pipeta de 2 μL. Mezcle la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Vórtice poco después para asegurar una mezcla adecuada.
nota: Para determinar la fluorescencia de fondo, también se debe realizar la tinción sin agregar el anticuerpo primario. Para ello, incubar el corte en una solución de anticuerpos sin anticuerpos primarios según el protocolo.
- Pasado el tiempo de incubación, retirar el tampón de bloqueo con una pipeta de plástico y añadir 250 μL de solución de anticuerpos que contenga anticuerpos primarios por pocillo. Incubar las rodajas con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C en un agitador.
- Al día siguiente, lavar las rodajas con tampón de lavado 1 3 veces durante 10 min a RT en una coctelera.
- Retire el medio con una pipeta de plástico y agregue 300 μL de tampón de lavado 1 por pocillo. Incubar en RT durante 10 min. Repite 3 veces.
- Durante las etapas de lavado, diluya los anticuerpos secundarios acoplados a fluoróforos en un tampón de anticuerpos en un tubo de reacción. Utilice 250 μL de tampón de anticuerpos por pocillo y añada la cantidad adecuada de anticuerpo (ver Tabla 2) pipeteándolo directamente en la solución con una pipeta de 2 μL. Mezcle la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Vórtice poco después para asegurar una mezcla adecuada.
cautela: Debido a que los anticuerpos son sensibles a la luz, todos los pasos a partir de este punto deben realizarse en la oscuridad.
- Después de los pasos de lavado, retire el tampón de lavado con una pipeta de plástico y agregue 250 μL de solución de anticuerpos que contenga anticuerpos secundarios por pocillo. Incubar las rodajas con anticuerpo secundario durante 90 min a RT en la oscuridad.
- Lave las rodajas con tampón de lavado 2 3x durante 10 min a RT.
- Durante las etapas de lavado, diluir 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en 0,1 M PB en una concentración de 1:2000.
- Retire el tampón de lavado 2 con una pipeta de plástico y añada 250 μL de solución de DAPI por pocillo. Incubar durante 5 min a RT en el agitador.
- Retire la solución de DAPI con una pipeta de plástico y añada 500 μL de PB de 0,1 M por pocillo con una pipeta de 1000 μL.
- Monte las rebanadas en portaobjetos de microscopio.
- Coloque un portaobjetos de microscopio debajo del estereoscopio. Con un pincel fino, agregue tres gotas separadas de 0,1 M PB en el portaobjetos. Coloque una rebanada por gota en el portaobjetos del microscopio.
- Utilice el pincel fino para aplanar y orientar las rodajas en el portaobjetos del microscopio.
- Cuando todas las rodajas estén colocadas correctamente, retire el exceso de PB con un pañuelo de papel y seque el portaobjetos con cuidado.
cautela: Evite secar las rodajas de cerebro por completo.
- Añada 80 μL de medio de inclusión en el portaobjetos. Baje con cuidado el cubreobjetos sobre el portaobjetos, incrustando así las rodajas de cerebro.
- Deje secar los portaobjetos en la campana extractora durante 1-2 h (cúbralos para evitar la exposición a la luz) y guárdelos en una caja de portaobjetos de microscopio a 4 °C.
nota: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Imágenes
- Después de que el medio de inclusión esté completamente endurecido, coloque el portaobjetos del microscopio debajo del microscopio confocal.
nota: La microscopía de epifluorescencia combinada con el software de deconvolución debería producir una calidad de imagen similar.
- Ajuste la configuración del láser aumentando o disminuyendo la intensidad del láser para cada canal de modo que queden pocos píxeles sobreexpuestos para garantizar la máxima distribución de los valores de gris.
- Adquiera tejidos virtuales de todo el trozo de cerebro para los diferentes canales.
- En el software de imágenes, seleccione la opción Mosaicos y delinee manualmente el corte de cerebro con la Configuración de región de mosaicos.
- Distribuya los puntos de apoyo por toda la región de mosaico y ajuste el enfoque de los diferentes puntos de apoyo pulsando Verificar regiones/posiciones de mosaico....
- Ajuste la configuración en el modo de adquisición de acuerdo con la resolución deseada y el tamaño de archivo de la imagen resultante e inicie el escaneo.
- Una vez finalizado el escaneo, utilice la función de costura para procesar el tejido virtual. Exporte el archivo como un .tif con la función Exportar imagen.
>3. Análisis por ordenador
- Cargue todos los canales individuales de una imagen en FIJI haciendo clic en Archivo| Abierto.
- Con la herramienta de selección a mano alzada, delinee un hemisferio en el canal DAPI. Cree una máscara de la selección haciendo clic en Editar| Selección| Crear máscara.
- Determine la intensidad de fluorescencia media para los canales individuales (Mover y sinaptofisina) haciendo clic en Analizar| medida.
nota: Asegúrese de seleccionar los diferentes canales para determinar los valores medios de intensidad de fluorescencia para cada canal.
- Copie la intensidad de fluorescencia media de los canales individuales en una hoja de cálculo.
- Determine la intensidad de fluorescencia media para los canales individuales en un área de interés delineando el área también con la herramienta de selección a mano alzada. Utilice un atlas del cerebro de un ratón como referencia.
- Repita los pasos 3.1-3.5 para todos los hemisferios y todas las áreas de interés.
nota: Determine los valores para cada hemisferio por separado para luego comparar los valores en un área de interés con los del hemisferio (ver paso 4.2).
>4. Manejo de datos
- En caso de que la fluorescencia de fondo sea alta, es posible que sea necesaria una sustracción de fondo. Para ello, determine la intensidad de fluorescencia media del corte procesado sin anticuerpo primario contra la proteína de referencia (en este caso: sinaptofisina) y reste ese valor de todos los valores obtenidos para las regiones y hemisferios cerebrales.
- Cuando se hayan determinado las intensidades medias de fluorescencia para los canales individuales para cada hemisferio y cada área de interés (véase el Cuadro 3), se calcule la relación entre Mover y sinaptofisina dividiendo el valor de Mover por el valor de sinaptofisina (amarillo en el Cuadro 3). Realice esta acción para cada hemisferio y cada área de interés por separado.
- Divida la relación obtenida para un área de interés por la razón obtenida para el hemisferio correspondiente (naranja en la Tabla 3) para determinar la relación entre el área de interés y el hemisferio.
- Para determinar la abundancia relativa de Mover, traduzca la relación obtenida en 4.2 a un porcentaje determinando su desviación de 1 (rojo en la Tabla 3). Por lo tanto, una relación de 1,25 daría una abundancia relativa de Mover de un 25% por encima de la media, y una relación de 0,75 produciría una abundancia relativa de Mover de un 25% por debajo de la media.
Tabla 1: Soluciones utilizadas en este protocolo.
| Fijador (500mL) |
Mix 20g paraformaldehído (total conc.: 4%)
50 mL 10x solución madre PBS (total conc.: 1x)
450 mL bidest H2OAdjust pH a 7.4 con NaOH
Nota: Para resolver el paraformaldehído en PBS, caliente la solución. No caliente a más de 70 oC, ya que el PFA se desintegra a temperaturas superiores a 70 oC.
Precaución: El PFA es tóxico, potencialmente cancerígeno y teratogénico. Use guantes cuando trabaje con PFA y trabaje debajo de la campana extractora. Evite la ingestión. |
| 0.1M PB (1L) |
Solución culata X
35.61 g Na2HPO4.2H 2O en 1 L bidest H2O | Solución madre Y
27.60 g NaH2PO 4.2H 2O en 1 L bidest H2O |
Mix 385 mL solución madre X
115 mL de solución madre Y
500 mL bidest H2O |
| Tampón de bloqueo (50 mL) |
Mix 1.25 mL de suero de cabra normal (total conc.: 2.5%)
1,25 mL de suero de burro normal (conc. total: 2,5%)
0,5 mL de tensioactivo no iónico (Triton-X100, total conc.: 1%)
47 mL 0,1 M PB |
| Tampón de anticuerpos (50 mL) |
Mix 0.25 mL de suero de cabra normal (total conc.: 0.5%)
0,25 mL de suero de burro normal (conc. total: 0,5%)
0,1 mL de tensioactivo no iónico (conc. total: 0,2%)
49,4 mL 0,1 m PB |
| Tampón de lavado 1 (50 mL) |
Mix 1 mL de suero de cabra normal (total conc.: 2 %)
49 mL 0,1 m PB |
| Tampón de lavado 2 (50 mL) |
Mix 0,5 mL de suero de cabra normal (total conc.: 1 %)
49,5 mL 0,1 m PB |
Tabla 2: Anticuerpos utilizados en este protocolo.
| Anticuerpos primarios |
| Dirigido contra | Especies hospederas | RIDO | concentración |
| instigador | conejo | AB_10804285 | 1:1000 |
| Sinaptofisina | cobayo | AB_1210382 | 1:1000 |
| Anticuerpos secundarios |
| Especies objetivo | Especies hospederas | Fluoróforo | concentración |
| conejo | burro | AlexaFluor 647 | 1:1000 |
| cobayo | cabra | AlexaFluor 488 | 1:1000 |
Tabla 3: Ejemplo de manejo de datos.
y el hemisferio
| Hemisferio |
| Hemisferio # | Intensidad media de fluorescencia Sinaptofisina (U.A.) | Intensidad media de fluorescencia Mover (A.U.) | Relación Mover/Sinaptofisina | | |
1
2
3
4
5
6 | 29.134
31.008
38.641
30.775
21.658
27.277 | 22.810
24.046
29.324
25.444
18.091
23.364 | =C3/B3 0,783
=C4/B4 0,775
=C5/B5 0,759
=C6/B6 0,827
=C7/B7 0,835
=C8/B8 0,857 | | |
| Hipocampo |
| Hemisferio # | Intensidad media de fluorescencia Sinaptofisina (U.A.) | Intensidad media de fluorescencia Mover (A.U.) | Relación Mover/Sinaptofisina | Relación entre el hemisferio | Abundancia relativa del motor (%) |
1
2
3
4
5
6 | 35.26
33.955
41.231
39.853
30.129
28.737 | 29.889
27.825
31.978
31.787
27.817
25.861 | =C11/B11 0,848
=C12/B12 0,819
=C13/B13 0,776
=C14/B14 0,798
=C15/B15 0,923
=C16/B16 0,900 | =D11/D3 1.083
=D12/D4 1.057
=D13/D5 1.022
=D14/D6 0.965
=D15/D7 1.105
=D16/D8 1.051 | =(E11-1)*100 8.269
=(E12-1)*100 5.673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3.528
=(E15-1)*100 10.530
=(E16-1)*100 5.064 |
