Evaluación de la integridad estructural de las uniones neuromusculares del músculo longitudinal dorsal en Drosophila

1. Congelación instantánea y bisección del tórax

1. Antes de comenzar las bisecciones, llene un matraz Dewar con nitrógeno líquido usando guantes crioprotectores adecuados y gafas de seguridad. Obtenga un rompecuchillas, hojas de pluma, un par de pinzas finas, hielo, 1x PBS helado y pinzas criogénicas.
2. Prepare un cubo de hielo para mantener frío 1x PBS.
3. Use el rompecuchillas para agarrar la hoja de plumas en ángulo y doblar la hoja para romper un trozo pequeño. El rompecuchillas puede entonces bloquear la cuchilla en su posición para su uso como un pequeño bisturí.
   nota: Una hoja debe durar para todos los grupos. Cambie si la cuchilla se rompe o se desafila.
4. Añada una punta de pipeta limpia al P200 y retire 1/5 de la punta para transportar las muestras.
5. Prepare un nuevo tubo de microcentrífuga para cada grupo y añada 200 μL de 1x PBS a cada tubo. Este segundo tubo se utilizará para recoger las preparaciones finales de DLM.
6. Retire todo el PBS 1x de los tubos con una pipeta Pasteur.
7. Con el equipo de protección adecuado, sumerja el tubo en el matraz de nitrógeno líquido durante 10 s con las pinzas criogénicas.
   nota: Los tubos deben cerrarse herméticamente para evitar que explote.
8. Retire el tubo del nitrógeno líquido y añada aproximadamente 300 μL de PBS 1x helado a las muestras con una pipeta Pasteur. Mantenga las muestras en hielo.
9. Añada 1x PBS helado a la placa de disección de 10 cm recubierta de elastómero de silicona y dispense el primer tórax con la pipeta modificada de 200 μL.
10. Coloque el tórax con el lado ventral hacia arriba. En una mano, use un par de pinzas sin filo para colocar el tórax y en la otra, use un par de pinzas finas para extirpar parte del ganglio torácico y exponer la línea media del tórax.
11. Use la línea media del tórax como guía para hacer un corte poco profundo a través de 1/3 del tórax con la cuchilla.
12. Retire la cuchilla del tórax y coloque el tórax en un ángulo de 45° con las pinzas romas. Vuelva a insertar la cuchilla y corte en línea recta por la línea media del tórax. Esto dará como resultado dos hemitórax.
13. Tome un hemitórax a la vez y elimine el exceso de tejido debajo de la fibra muscular DLM F (Figura 1B), la fibra más ventral. Use la cuchilla para hacer con cuidado uno o dos cortes para eliminar el exceso de tejido sin dañar los DLM.
14. Una vez aislado, transfiera el hemitórax al tubo correcto con 1x PBS.
15. Repita los pasos 1.6 a 1.14 hasta que se hagan 10 hemitóratos disecados por grupo.

2. Tinción estructural

1. Después de dividir las muestras de tórax, coloque el tejido en un tampón de bloqueo (1x PBS con 0,1% de suero de cabra normal y 0,2% de Triton X-100 a pH 7,4) para permeabilizar el tejido y evitar tinciones inespecíficas. Utilice una pipeta Pasteur para eliminar el exceso de 1x PBS y añada 1,5 ml de tampón de bloqueo a cada tubo. Bloquee los pañuelos durante al menos 1 h a 4 °C.
2. Preparar las muestras para la tinción estructural utilizando un anticuerpo conjugado con fluorescencia, la peroxidasa de rábano picante 488 (anti-HRP-488) en una dilución de 1:200 y la faloidina-647 en una dilución de 1:1000 en tampón de bloqueo para teñir las neuronas motoras y el tejido muscular, respectivamente. Haga suficiente tinte para tener 150 μL por tubo. Guarde la mancha a 4 °C cubierta con papel de aluminio o en una caja oscura hasta que esté lista para teñir.
3. Después del bloqueo, retire el exceso de tampón de bloqueo con una pipeta Pasteur de vidrio.
4. Antes de dispensar el tinte estructural, vórtice el tinte. Añade 150 μL de la mancha a cada tubo. Coloque las muestras en una caja oscura en el rotador a temperatura ambiente durante 2 h.
5. Retire la mancha y lave los pañuelos cuatro veces en 1,5 mL de temperatura ambiente, 1x PBS con Triton X-100 al 0,3% durante 5 minutos en el rotador en una caja oscura. Las muestras ya están listas para montarse en una diapositiva.

>3. Tejido de montaje

1. Después de lavar las muestras en PBST, prepare un portaobjetos de microscopio para montar el tejido para la tinción. Prepare suministros adicionales, como cubreobjetos de vidrio, una pipeta P200, puntas de pipeta de 200 μL, tijeras, refuerzos transparentes, pinzas de borde recto, medios de montaje fluorescentes antidecoloración, esmalte de uñas y una caja oscura para cubrir los portaobjetos.
2. Etiqueta el portaobjetos para identificar las muestras y límpialo con toallitas Kim para eliminar las manchas.
3. Para asegurarse de que el cubreobjetos no dañe las muestras de hemitórax, construya un "puente" con etiquetas de refuerzo. Corte una etiqueta de refuerzo por la mitad y coloque cada mitad a una distancia aproximada de 15 mm. Esta distancia debe ser menor que el ancho del cubreobjetos. Repita este paso cuatro veces para completar un "puente" de 5 etiquetas de altura.
4. Tome la pipeta P200 y modifique una punta cortando 1/5 de la punta para transferir las muestras al portaobjetos. Las muestras deben transferirse al portaobjetos en el centro del puente.
5. Tome el borde de una toallita de laboratorio y elimine el exceso de PBST. Con pinzas, coloque los DLM de manera que todas las muestras queden hacia arriba con el músculo hacia arriba y la cutícula hacia abajo.
6. Con una punta de pipeta P200 estándar, aplique 70 μL de medio de montaje al portaobjetos, evitando las burbujas de aire. Dispense los medios en un patrón circular dentro de los refuerzos, comenzando desde el exterior hacia el centro.
7. Coloque un cubreobjetos sobre los refuerzos.
8. Usa esmalte de uñas para cubrir los bordes exteriores alrededor del perímetro del cubreobjetos. Aplicar generosamente para formar un sellado completo del tejido.
9. Coloque el portaobjetos sobre una superficie plana en la oscuridad, dejando que se seque al menos 10 minutos y evite el fotoblanqueo o la pérdida de fluorescencia. Las diapositivas ahora se pueden usar para obtener imágenes de inmediato o, de lo contrario, se pueden almacenar en una carpeta de diapositivas a -20 °C para verlas más tarde.

Figura 1: Denervación progresiva de las sinapsis de DLM en un modelo de Drosophila de ELA. (A) La generación de moscas transgénicas de ELA que expresan una forma mutante humana de proteína de unión al alquitrán de 43 kDa (TDP-43) se muestra en el esquema. (B) La ilustración representa la forma y orientación de un hemitórax en un Drosophila adulto. Utilizando el protocolo, podemos observar la pérdida progresiva de la integridad sináptica de las sinapsis NMJ de DLM a través de la tinción estructural de las neuronas motoras con HRP (verde) y del tejido muscular con faloidina (magenta). Nuestro modelo representa la pérdida de integridad sináptica en un modelo adulto de ELA a través de la generación de moscas adultas que expresan un mutante de TDP-43M337V humano en neuronas motoras (Figura 1F-H) en comparación con las moscas WT (Figura 1C-E) en la fibra muscular C. Las flechas resaltan ejemplos de una sinapsis WT (Figura 1C) y un ejemplo de pérdida de integridad sináptica. Barra de escala = 20 μm con un aumento de 63x.