Evaluación de la integridad estructural de las uniones neuromusculares del músculo longitudinal dorsal en Drosophila

Resumen

Fuente: Sidisky, J. M., et al. Visualizando la degeneración sináptica en Drosophila adulta en asociación con la neurodegeneración. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra un protocolo para evaluar la integridad estructural de las uniones neuromusculares en los músculos longitudinales dorsales de Drosophila. El procedimiento consiste en teñir neuronas y músculos con dos anticuerpos distintos y comparar los patrones de fluorescencia entre moscas mutantes y salvajes. Una reducción en la tinción neuronal en moscas mutantes indica neurodegeneración, mientras que la estructura muscular permanece intacta.

Protocolo

1. Congelación instantánea y bisección del tórax

1. Antes de comenzar las bisecciones, llene un matraz Dewar con nitrógeno líquido usando guantes crioprotectores adecuados y gafas de seguridad. Obtenga un rompecuchillas, hojas de pluma, un par de pinzas finas, hielo, 1x PBS helado y pinzas criogénicas.
2. Prepare un cubo de hielo para mantener frío 1x PBS.
3. Use el rompecuchillas para agarrar la hoja de plumas en ángulo y doblar la hoja para romper un trozo pequeño. El rompecuchillas puede entonces bloquear la cuchilla en su posición para su uso como un pequeño bisturí.
   nota: Una hoja debe durar para todos los grupos. Cambie si la cuchilla se rompe o se desafila.
4. Añada una punta de pipeta limpia al P200 y retire 1/5 de la punta para transportar las muestras.
5. Prepare un nuevo tubo de microcentrífuga para cada grupo y añada 200 μL de 1x PBS a cada tubo. Este segundo tubo se utilizará para recoger las preparaciones finales de DLM.
6. Retire todo el PBS 1x de los tubos con una pipeta Pasteur.
7. Con el equipo de protección adecuado, sumerja el tubo en el matraz de nitrógeno líquido durante 10 s con las pinzas criogénicas.
   nota: Los tubos deben cerrarse herméticamente para evitar que explote.
8. Retire el tubo del nitrógeno líquido y añada aproximadamente 300 μL de PBS 1x helado a las muestras con una pipeta Pasteur. Mantenga las muestras en hielo.
9. Añada 1x PBS helado a la placa de disección de 10 cm recubierta de elastómero de silicona y dispense el primer tórax con la pipeta modificada de 200 μL.
10. Coloque el tórax con el lado ventral hacia arriba. En una mano, use un par de pinzas sin filo para colocar el tórax y en la otra, use un par de pinzas finas para extirpar parte del ganglio torácico y exponer la línea media del tórax.
11. Use la línea media del tórax como guía para hacer un corte poco profundo a través de 1/3 del tórax con la cuchilla.
12. Retire la cuchilla del tórax y coloque el tórax en un ángulo de 45° con las pinzas romas. Vuelva a insertar la cuchilla y corte en línea recta por la línea media del tórax. Esto dará como resultado dos hemitórax.
13. Tome un hemitórax a la vez y elimine el exceso de tejido debajo de la fibra muscular DLM F (Figura 1B), la fibra más ventral. Use la cuchilla para hacer con cuidado uno o dos cortes para eliminar el exceso de tejido sin dañar los DLM.
14. Una vez aislado, transfiera el hemitórax al tubo correcto con 1x PBS.
15. Repita los pasos 1.6 a 1.14 hasta que se hagan 10 hemitóratos disecados por grupo.

2. Tinción estructural

1. Después de dividir las muestras de tórax, coloque el tejido en un tampón de bloqueo (1x PBS con 0,1% de suero de cabra normal y 0,2% de Triton X-100 a pH 7,4) para permeabilizar el tejido y evitar tinciones inespecíficas. Utilice una pipeta Pasteur para eliminar el exceso de 1x PBS y añada 1,5 ml de tampón de bloqueo a cada tubo. Bloquee los pañuelos durante al menos 1 h a 4 °C.
2. Preparar las muestras para la tinción estructural utilizando un anticuerpo conjugado con fluorescencia, la peroxidasa de rábano picante 488 (anti-HRP-488) en una dilución de 1:200 y la faloidina-647 en una dilución de 1:1000 en tampón de bloqueo para teñir las neuronas motoras y el tejido muscular, respectivamente. Haga suficiente tinte para tener 150 μL por tubo. Guarde la mancha a 4 °C cubierta con papel de aluminio o en una caja oscura hasta que esté lista para teñir.
3. Después del bloqueo, retire el exceso de tampón de bloqueo con una pipeta Pasteur de vidrio.
4. Antes de dispensar el tinte estructural, vórtice el tinte. Añade 150 μL de la mancha a cada tubo. Coloque las muestras en una caja oscura en el rotador a temperatura ambiente durante 2 h.
5. Retire la mancha y lave los pañuelos cuatro veces en 1,5 mL de temperatura ambiente, 1x PBS con Triton X-100 al 0,3% durante 5 minutos en el rotador en una caja oscura. Las muestras ya están listas para montarse en una diapositiva.

>3. Tejido de montaje

1. Después de lavar las muestras en PBST, prepare un portaobjetos de microscopio para montar el tejido para la tinción. Prepare suministros adicionales, como cubreobjetos de vidrio, una pipeta P200, puntas de pipeta de 200 μL, tijeras, refuerzos transparentes, pinzas de borde recto, medios de montaje fluorescentes antidecoloración, esmalte de uñas y una caja oscura para cubrir los portaobjetos.
2. Etiqueta el portaobjetos para identificar las muestras y límpialo con toallitas Kim para eliminar las manchas.
3. Para asegurarse de que el cubreobjetos no dañe las muestras de hemitórax, construya un "puente" con etiquetas de refuerzo. Corte una etiqueta de refuerzo por la mitad y coloque cada mitad a una distancia aproximada de 15 mm. Esta distancia debe ser menor que el ancho del cubreobjetos. Repita este paso cuatro veces para completar un "puente" de 5 etiquetas de altura.
4. Tome la pipeta P200 y modifique una punta cortando 1/5 de la punta para transferir las muestras al portaobjetos. Las muestras deben transferirse al portaobjetos en el centro del puente.
5. Tome el borde de una toallita de laboratorio y elimine el exceso de PBST. Con pinzas, coloque los DLM de manera que todas las muestras queden hacia arriba con el músculo hacia arriba y la cutícula hacia abajo.
6. Con una punta de pipeta P200 estándar, aplique 70 μL de medio de montaje al portaobjetos, evitando las burbujas de aire. Dispense los medios en un patrón circular dentro de los refuerzos, comenzando desde el exterior hacia el centro.
7. Coloque un cubreobjetos sobre los refuerzos.
8. Usa esmalte de uñas para cubrir los bordes exteriores alrededor del perímetro del cubreobjetos. Aplicar generosamente para formar un sellado completo del tejido.
9. Coloque el portaobjetos sobre una superficie plana en la oscuridad, dejando que se seque al menos 10 minutos y evite el fotoblanqueo o la pérdida de fluorescencia. Las diapositivas ahora se pueden usar para obtener imágenes de inmediato o, de lo contrario, se pueden almacenar en una carpeta de diapositivas a -20 °C para verlas más tarde.

Resultados

Figura 1: Denervación progresiva de las sinapsis de DLM en un modelo de Drosophila de ELA. (A) La generación de moscas transgénicas de ELA que expresan una forma mutante humana de proteína de unión al alquitrán de 43 kDa (TDP-43) se muestra en el esquema. (B) La ilustración representa la forma y orientación de un hemitórax en un Drosophila adulto. U...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
32% Formaldehído	Ciencias de la Microscopía Electrónica	Año 15714	Conservación de tejidos
Balancín de banco	Genesee Científico	31-302	Rotación de muestras durante la tinción
Rompedor de cuchillas	Herramientas de Bellas Ciencias	10053-09	Se utiliza para sujetar la hoja de la pluma
cubreobjetos	Fisher Científico	12548A	Para el montaje de tejido
guantes criogénicos	VWR	97008-198	Proteger las manos del nitrógeno líquido
pinzas criogénicas	VWR	82027-432	Sostenga el tubo de 2.0 mL en nitrógeno líquido
matraz dewar-1900 mL	Thomas Científico	5028M54	Retención de nitrógeno líquido
Cuchillas de plumas	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72002-01	Hojas de bisturí
Forecps finos x 2	Herramientas de Bellas Ciencias	11252-20	Un par fino para despejar la línea media del tórax. El otro par se puede desafilar con una piedra de afilar.
Anti HRP conjugado por FITC	Laboratorios Jackson	123-545-021	Tiñe las neuronas motoras. Se utiliza a una concentración de 1:100
caja de congelación (negro)	Fisher Científico	14100F	Protege las muestras de la luz
Pipetas Pasteur de vidrio	VWR	14637-010	Se utiliza para transferir muestras
Portaobjetos de vidrio	Fisher Científico	12550143	Para el montaje de tejido
Medios de montaje (Vectashield) anti-decoloración	VWR	101098-042	El medio de montaje conserva la señalización fluorescente
esmalte	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72180	Sella los portaobjetos del microscopio
Suero de cabra normal	Fisher Científico	PCN5000	Evita la unión inespecífica de anticuerpos
Pincel	Genesee Científico	59-204	Transferencia de moscas
Pbs	Fisher Científico	10-010-023	Solución salina para diseccionar y teñir
Faloidina 647	Abcam	AB176759	Tiñe la F-actina en el tejido muscular. Se utiliza a una concentración de 1:1000
Placa de Petri de plástico (100 mm)	VWR	25373-100	Plato de disección
Etiquetas de refuerzo	W.B. Mason	AVE05722	Proporciona soporte para el cubreobjetos de vidrio sobre el tejido montado
Bloque de afilado	Grainger	1RDF5	Mantener las pinzas finas afiladas y también desafilar el par separado
Carpeta de diapositivas	VWR	10126-326	Almacenamiento de muestras
Tijeras de oficina estándar	W.B. Mason	ACM40618	Etiquetas de refuerzo de corte
Sylgard 184	Ciencias de la Microscopía Electrónica	24236-10	Recubrimiento para plato de disección
Tritón-X-100	Ciencias de la Microscopía Electrónica	22140	Ayuda a permeabilizar el tejido
Vannas Diseccion Sissors	Herramientas de Bellas Ciencias	1500-00	Ued para extirpar las patas de mosca y hacer una incisión en el tórax