Investigación de una lesión cerebral de larva de pez cebra mediante microscopía electrónica de transmisión de barrido a gran escala

Resumen

Fuente: Kuipers, J. et al., Microscopía electrónica de transmisión de barrido a gran escala (nanotomía) del cerebro de pez cebra sano y lesionado.J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra un método para investigar la lesión cerebral de las larvas de pez cebra utilizando microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) a gran escala, una técnica que combina elementos de microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para producir imágenes de alta resolución. Describe los pasos involucrados en la preparación de muestras y la adquisición de imágenes STEM de alta resolución para identificar lesiones cerebrales.

Protocolo

>1. Preparación de la muestra

1. Fijación e incrustación
   1. fijación
      1. Anestesiar las larvas de peces en tricaína (0,003%) añadidas al agua de pez cebra E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl₂, 0,33 mM de MgSO_4, 10 mM de HEPES, pH 7,6) y probar la profundidad de la anestesia pinchando suavemente con una punta de pipeta de 200 μl bajo un microscopio de disección hasta que ya no se detecte movimiento (Figura 1A).
      2. Al procesar muestras para microscopía electrónica correlativa (EM) después de adquirir datos de imagen in vivo utilizando imágenes confocales o de 2 fotones en agarosa al 1,8% como se describe, fije las larvas en agarosa utilizando paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga Triton-X-100 (0,05%).
      3. Corte las larvas de agarosa y procese para EM a gran escala.
      4. Fije las larvas en paraformaldehído fresco al 4% en PBS que contiene Triton-X-100 (0.05%) durante 2 horas a temperatura ambiente en tubos de plástico.
         nota: Las células cultivadas en cultivo (in vitro) pueden fijarse directamente en glutaraldehído, como se describe en el siguiente paso (1.1.1.5).
      5. Retire la solución y agregue 100 μl de PFA al 0,5%, glutaraldehído (GA) al 2% y cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4). Almacenar durante la noche a 4 °C. Enjuagar las muestras dos veces en cacodilato de sodio 0,1 M.
      6. Corta las cabezas de las larvas rostralmente hacia el cerebro posterior para facilitar la penetración del osmio. Use jeringas/pinzas finas.
      7. Larvas de postfijo en tetróxido de osmio al 1% (OsO₄)/ferrocianuro de potasio al 1,5% (K₄[Fe(CN)₆]) en cacodilato de sodio 0,1 M sobre hielo durante 2 horas y enjuague 3 x 5 min en H₂O bidestilado.
      8. Deshidratar en etanol en incubaciones de 20 min en concentraciones crecientes de etanol (50%, 70%, 3 veces 100%).
   2. Incrustación
      1. Prepare la resina epoxi de acuerdo con las recetas estándar utilizadas en los laboratorios de EM.
         nota: Utilizamos resina epoxi de la siguiente manera: mezcle 19,8 g de éter glicídico 100, 9,6 g de anhídrido de ácido 2-dodecenilsuccínico y 11,4 g de anhídrido metilnádico utilizando un agitador magnético. Añadir 0,5 g de DMP-30 (tris-(dimetilaminometil) fenol) y mezclar de nuevo.
      2. Incubar las larvas durante la noche en resina epoxi al 50% en etanol (v/v) mientras rota (RT).
      3. Reemplace la resina epoxi diluida con resina pura. Incuba durante 30 minutos, vuelve a añadir resina fresca e incuba durante otros 30 minutos. De nuevo, refresca la resina y luego incuba 3 horas a RT, seguidas de 15 minutos a 58 °C y otras 1 hora a RT a baja presión (200 mbar).
      4. Oriente las cabezas en moldes de inclusión plana de silicona disponibles comercialmente bajo un microscopio de disección usando una aguja o un palillo de dientes con la parte anterior mirando hacia el lado del molde o según sea necesario (Figura 1B).
      5. Polimerizar la resina epoxi durante la noche a 58 °C. Si la resina epoxi sigue siendo demasiado blanda, deje que otro día se polimerice y se endurezca a 58 °C. Pruebe la rigidez aplicando presión con pinzas. Si esto deja fácilmente una hendidura, espere otro día para polimerizar y endurecer a 58 °C. Cuando la muestra esté completamente endurecida, proceda al recorte y seccionamiento.
      6. Recorta el exceso de resina del trozo con cuchillas de afeitar (Figura 1B).
2. Seccionamiento, contraste y montaje
   1. seccionamiento
      1. Sección del bloque de resina epoxi con un ultramicrótomo.
      2. Utilice un cuchillo de vidrio o un cuchillo de histocuchillo de diamante para cortar secciones semifinas (500 nm) para la tinción con azul de toluidina/fucsina básica (Figura 1D) para detectar la posición correcta.
      3. Transfiera secciones semifinas en portaobjetos microscópicos recogiéndolos con una pipeta Pasteur de vidrio cuya punta se haya cerrado fundiendo en una llama. Secar en una placa caliente hasta que no quede agua. Teñir durante 10 segundos con azul de toluidina al 1% en agua en una placa caliente, y después de enjuagar con agua, teñir durante 10 segundos con fucsina básica al 0,05% en tetraborato de sodio al 1%. Examine con un microscopio óptico normal a una temperatura de 10X a 40X.
      4. Cuando se alcance el sitio/orientación adecuado dentro del cerebro, continúe seccionando el bloque de resina epoxi con un cuchillo de diamante para cortar secciones ultrafinas (~ 70 nm; Figura 1E)
      5. Utilice estructuras anatómicas fácilmente identificables dentro y alrededor del cerebro, incluidas las fosas olfativas, los ojos y los límites de la materia gris-blanca, para identificar la región de interés durante el corte ultrafino y para ajustar el ángulo de corte cuando se inclina la muestra.
      6. Monte la sección en rejillas de cobre L2 x 1 de una sola ranura (Figura 1F), para permitir la adquisición ininterrumpida por las barras de la rejilla. Utilice rejillas recubiertas de Formvar para soportar las secciones.
   2. contrastante
      1. Teñir secciones ultrafinas en rejillas durante 2 minutos con acetato de uranilo al 2% en metanol, seguido de citrato de plomo Reynolds durante otros 2 minutos.

>2. Adquisición de imágenes

1. Microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) a gran escala
   nota: Utilizamos EM de escaneo con un generador de escaneo externo capaz de adquirir múltiples campos de visión grandes a alta resolución mediante detección STEM. Por lo general, una imagen generada de esta manera es equivalente a los campos de visión de ~ 100 imágenes de microscopio electrónico de transmisión (TEM), lo que reduce significativamente la cantidad de unión.
   1. Montaje de la muestra en el microscopio
      1. Coloque la rejilla con la sección en el portamuestras de rejilla múltiple y transfiérala a la cámara del SEM.
   2. Alineación del detector STEM
      1. Coloque la rejilla con la muestra debajo del haz y muévala hacia arriba para que esté a unos 5 mm del poste de la lente. Adquiera una imagen a 20 kV utilizando el detector en la lente.
      2. Concéntrese en el borde de la rejilla y ajuste la distancia de trabajo a 4,0 mm.
      3. Mueva el portamuestras a una posición segura y traiga el detector STEM.
      4. Centre el orificio del detector STEM en el campo de imagen girando los tornillos de ajuste mientras toma imágenes a la máxima velocidad con el detector en la lente.
      5. Traiga con cuidado el portamuestras que encajará entre el poste de la lente y el detector.
      6. Adquiera una imagen con el detector de lentes para asegurarse de que esté en el área de la sección.
      7. Cambie a la detección STEM (ganancia, medio y todos los cuadrantes configurados en 'menos'), adquiera una imagen y seleccione el área que desea escanear.
      8. Aumente el voltaje de aceleración a 21 kV y espere la estabilización del haz (imagen estable nuevamente), luego vaya a 29 kV en pasos de 2 kV.
   3. Adquisición de imágenes
      1. Preirradie la muestra (para evitar los cambios de brillo causados por el haz de electrones) alejando el zoom para que toda el área que se va a escanear se ajuste a la ventana de la imagen.
      2. Cambie la apertura a 120 μm (para mantener el rango dinámico adecuado, las ganancias del detector deben reducirse en un paso).
      3. Desenfoca para que la imagen quede borrosa.
      4. Haga que el área escaneada sea lo más ajustada posible utilizando la opción de escaneo de área reducida.
      5. Ajuste la velocidad de escaneo de modo que un fotograma se escanee en aprox. 1 - 2 seg.
         nota: Dependiendo del tamaño y el tejido, esto suele tardar de 1/2 hora (100 x 100 μm de campo de visión [FOV]) a hasta 3 horas (1.000 x 500 μm).
      6. Acérquese al menos 100X y escanee un área pequeña durante 10 seg.
         nota: Cuando esta área no cambia de brillo en comparación con su entorno, la irradiación previa es suficiente.
      7. Recupera la apertura de 30 μm (y la ganancia STEM en medio)
      8. Concéntrese en la muestra.
      9. Alinee la apertura con el bamboleo (con un aumento de ~ 40,000X).
      10. Mientras está enfocado, seleccione el área/característica más clara y establezca la velocidad de escaneo de manera que los detalles sean visibles.
      11. En el software del microscopio, ajuste el brillo y el contraste observando cuidadosamente el histograma para mantener todos los píxeles en el rango dinámico. Haga lo mismo con el área/características más oscuras.
      12. Vuelve a la zona brillante y compruébalo de nuevo. Esté en el lado seguro para que haya algo de espacio a ambos lados del histograma.
      13. Aléjese para que el área completa que se va a escanear se ajuste a la ventana de imágenes e inicie el programa de adquisición de áreas grandes.
      14. Utilice la opción del asistente para configurar un mosaico seleccionando un área de la pantalla. Utilice un tamaño de píxel de 2 a 5 nm, dependiendo de los detalles que sean necesarios. Utilice un tiempo de permanencia de 3 μs para STEM.
      15. Seleccione la opción "enfoque automático en mosaico anterior", utilice el enfoque automático del software de adquisición a gran escala con la configuración predeterminada de la empresa, marque la casilla "verificar la configuración antes de la ejecución" y defina dónde guardar los datos.
      16. Presione "optimizar" para verificar la configuración del microscopio.
          nota: Ahora, se mostrará el tiempo necesario. Esto puede ser de hasta 72 horas para áreas de 1 x 0,5 mm.
      17. En la ventana, la "resolución máxima de mosaicos" escribe 20,000, por lo que los mosaicos individuales no serán más grandes que 20k x 20k, evitando efectos de borde romo. Presione "ejecutar".
      18. Cuando se le solicite que compruebe el enfoque y el brillo/contraste (B/C), apague el generador de escaneo externo y ajuste cuidadosamente el enfoque y el astigmatismo en el software del microscopio. No cambie B/C.
          nota: La platina se puede mover y cambiar la ampliación, pero la ampliación debe ajustarse al tamaño de píxel deseado.
      19. Vuelva a encender el generador de escaneo externo y presione "continuar".

Resultados

Figura 1: Flujo de trabajo de microscopía electrónica tisular a gran escala en cerebros de pez cebra. (A)Larva de pez cebra de 7 días de edad. (B) Cabezas de larvas de pez cebra incrustadas una al lado de la otra en resina epoxi. (C) Cuchillo de vidrio para el corte semifino y la orientación de la muestra. (D) Sección semifina representativa teñida ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
productos químicos
Agarosa de bajo punto de fusión	VWR	444152G
Tricaína	sigma	E10521
Tritón- X-100	sigma	X100
Glutaraldehído	Policiencias	Año 1909
Cacodilato de sodio	sigma	C0250
de osmiotetróxido	Ciencias de la Microscopía Electrónica	Año 19114
potasioferrocianuro (K4[Fe(CN)]6)	Merck	4984
etanol	VWR	20821.365
acetato de uranilo	Merck	8473
de sodiotetraborato	Merck	1063808
Tolduidene azul	Merck	Año 1273
Fucsina básica	BDH	340324
Citrato de plomo	BDH	terminado
EPÓN
Anhídrido de ácido 2-dodecenilsuccínico	Serva	20755
anhídrido metilnádico	Serva	29452
Éter glícido 100	Serva	21045
DMP-30	Policiencias	553
Molde de incrustación plano estándar	Ciencias de la Microscopía Electrónica	70901
cuchillo de diamante	Diatome Inc.
Rejillas de cobre	Ciencias de la Microscopía Electrónica
Cinta de carbono de doble cara	Ciencias de la Microscopía Electrónica
Escaneo EM Zeiss Supra55	Zeiss
ultramicrótomo Leica EM UC7	Leica
Generador de escaneo externo Atlas	Fibics