Diferenciación y Maduración de Células Madre Embrionarias Humanas en Organoides Neurales

Resumen

Fuente: Cosset, E., et al. Organoides neuronales humanos para el estudio del cáncer cerebral y las enfermedades neurodegenerativas. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, se muestra un protocolo paso a paso para células madre embrionarias humanas en organoides neuronales. El método consiste en inducir la formación de rosetas neuronales, seguida de una maduración controlada y un cultivo final en una membrana hidrofóbica para lograr organoides neuronales completamente desarrollados.

Protocolo

1. Mantenimiento y cultivo de células madre embrionarias humanas indiferenciadas (hESCs)

1. Realice el mantenimiento y la expansión de hSEC en condiciones sin alimentador mediante el recubrimiento previo de placas con una matriz extracelular específica.
   1. Descongele 300 μL de matriz extracelular a 4 °C (concentración de rango típico de 18-22 mg/mL, mantener en hielo) y mezcle suavemente con 15 mL de medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) para evitar la gelificación prematura de la matriz extracelular. Añadir 7,5 mL de la matriz extracelular a ambos matraces T150.
   2. Incubar las placas recubiertas con matriz extracelular a 37 °C durante al menos 1 h (máximo durante la noche).
   3. Retire las hESC del medio y de la semilla hasta una densidad de 6,5 x 104 celdas/^cm2.
2. Mantener H1 (línea celular hESC) en medio hESC y 1% de penicilina/estreptomicina.
3. Pasar las células con procedimiento enzimático: añadir 7,5 mL de solución enzimática a un matraz T75 cm2 durante un período de 1-2 min a 37 °C. Una vez que las células estén completamente separadas, agregue 7,5 mL de DMEM-F12 y luego centrifugue durante 5 min a 300 x g. Para permitir una mejor supervivencia, se vuelven a colocar las células a la densidad deseada en placas recubiertas de matriz extracelular, en el mismo medio que contiene un inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) (10 μM) durante 24 h.

2. Organoides neuronales derivados de hESC

1. 24 h antes de iniciar el cultivo 3D, sustituya el medio hESC por un medio sin suero suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK (ambos componentes son necesarios para favorecer la supervivencia celular y la formación espontánea de neurosferas durante la fase de agregación en una placa de micropocillos). Las celdas deben estar al 60% de confluencia. Al día siguiente (día 0), separar las colonias de hESC como células individuales: retirar el medio, enjuagar con PBS sin Ca²⁺/Mg²⁺, añadir 5 mL de solución de disolución enzimática e incubar a 37 °C durante 1-2 min.
2. Recoja las células en un medio libre de suero suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK y centrifugue a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y cuente las células en 10 mL de medio libre de suero suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK.
3. Paralelamente, enjuague la placa de micropocillos con 2 ml de medio libre de suero por pocillo y centrifugue la placa a 1200 x g durante 5 minutos para eliminar todas las burbujas, lo que puede prevenir la formación de neurosferas.
4. Prepare 28,2 x 10⁶ de células en 12,5 mL de medio libre de suero suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK. Dispensar 1000 células/micropocillo. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y colocar la placa en la incubadora a 37 °C durante la noche (máximo 36 h). Por ejemplo, para obtener 30 organoides neuronales humanos, utilice un matraz T150 al 70%-80% de la confluencia (unos 30 millones de células).
5. Al día siguiente (día 1), recoja las esferas (con un P1000) y colóquelas en un plato de 6 pocillos. En cada pocillo, agregue 2 mL de medio B27 y DMEM-F12 GlutaMAX y medio Neurobasal (mezclar en 1:1), complementado con suplementos de B27 al 1% y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA). Para promover una inducción neuronal rápida, complemente el medio con un cóctel de inhibición de doble SMAD (Sma y Mad Related Protein) compuesto por 10 μM de TGFβ (Factor de Crecimiento Transformante-beta)/Activina/Inhibidor Nodal y 0,5 μM de inhibidor de la proteína morfogénica ósea (BMP). A partir de este paso, las esferas se cultivan en rotación (60 rpm, agitador orbital). La rotación es fundamental para evitar que las esferas se peguen entre sí o a la placa.
6. Cambie el medio cada 2-3 días: doble la placa y deje caer las esferas durante 5 minutos, retire la mitad del medio (2 mL) y agregue 2 mL de medio B27 fresco suplementado con factores de crecimiento e inhibidores. No centrifugar las esferas.
7. Realizar la inducción neuronal de acuerdo con el siguiente curso de tiempo:
   1. De los días 1 a 4, cultive las esferas en medio B27 suplementado con SMAD dual. El cóctel de inhibición de SMAD dual (10 μM de TGFβ/Activina/Inhibidor nodal y 0,5 μM de inhibidor de BMP) promueve la inducción neuronal.
   2. A partir de los días 4-11, promueva la proliferación de rosetas neurales derivadas de hESC (en las esferas), mediante la adición de 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y 10 ng/mL de factor básico de fibroblastos (bFGF) al medio B27 suplementado con cóctel de doble SMAD.
      nota: En el día 11, la mayoría de las células deberían ser positivas para Nestin.
   3. A partir de los días 11-13, cultive las esferas en medio B27 suplementado con un inhibidor de BMP de 0,5 μM.
   4. A partir de los días 13-21, cultive las esferas en medio B27 suplementado con 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado glial (GDNF), 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y 1 μM de inhibidor de la γ-secretasa. El GDNF y el BDNF promueven la diferenciación neuronal y glial. El inhibidor de la γ-secretasa permite una mayor maduración neuronal.
   5. El día 21, coloque las esferas (alrededor de 1.000 esferas) en una membrana hidrofílica de politetrafluoroetileno (PTFE) (6 mm de diámetro, 0,4 μm) depositada en un inserto de placa de cultivo diseñado para placas de 6 pocillos. Detenga cualquier rotación de este paso. La presencia de rosetas, observada con un microscopio de campo claro, indica el inicio de la diferenciación neuronal. Las rosetas neurales se pueden observar 2-3 días después de colocar las esferas en la membrana de PTFE.
   6. Agregue 1 mL de medio B27 suplementado con factores de crecimiento e inhibidores (como se indica a continuación) a cada pocillo debajo del inserto de membrana, cada 2-3 días (generalmente los lunes, miércoles y viernes), durante las siguientes 3 semanas de diferenciación.
   7. De los días 21 a 25, cultive organoides neuronales humanos en el mismo medio de maduración neuronal.
   8. A partir de los días 25-28, solo complementar el medio B27 con 1 μM de inhibidor de la γ-secretasa.
   9. A partir de los días 28-39, deje de agregar el inhibidor de la γ-secretasa y continúe con el cultivo de organoides neurales humanos solo en el medio B27.
      nota: Después de 3 semanas, los organoides neurales están listos para usar para la implantación de GIC. A lo largo de la maduración neuronal, se observó una disminución del marcador neural inmaduro nestina y un aumento de los marcadores neurales maduros β3-tubulina y GFAP.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 6 pocillos (placa de 6 pocillos)	Halcón / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (Placas de cultivo de micropocillos)	Tecnologías StemCell	34421
Suplementos de B27 (B27)	Tecnologías de la Vida / Invitrogen	Año 1238	Para ambos protocolos, solución madre 100x, solución final 1x
Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)	Guía de células	GFH1-2	Para ambos protocolos, solución madre 100 μg/mL en H2O puro, solución final 20 ng/mL
Compuesto E, un inhibidor de la γ-secretasa (inhibidor de la γ-secretasa)	Calbiochem	CAS 209986-17-4	Para ambos protocolos (inhibidor de la gamma-secretasa XXI), solución madre 5 mM en DMSO, solución final 1 μM
Dimetilsulfóxido puro (DMSO)	Sigma-Aldrich	C6164	Disolvente de compuestos, listo para usar
Medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM)	Tecnologías de la Vida	12491-015	Para cultivo celular, listo para usar
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mix F-12 (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Para cultivo celular, listo para usar
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Tecnologías de la Vida	AM9912	Para cultivo celular, listo para usar
Factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF)	Guía de células	GFH2-2	Para ambos protocolos, solución madre 100 μg/mL en H2O puro, solución final 20 ng/mL
Membrana hidrofílica de politetrafluoroetileno (membrana de PTFE)	Interfaz BioCell	terminado
LDN-193189 (inhibidor de BMP)	Axon Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, solución madre 5 mM en DMSO, solución final 0,5 μM
L-glutamina (L-glutamina)	Gibco	25030081	L-glutamina (200 mM), solución madre 200 mM, solución final 2 mM
Matrigel (matriz extracelular)	BD Biociencias	354277	Matriz calificada para hESC, solución madre 18-22 mg/mL, solución final 180-220 μg/mL
Inserto de placa de cultivo Millicell-CM (0,4 μm) (Inserto de placa de cultivo)	Millipore	PICM03050
Anticuerpo monoclonal anti-β-tubulina III	sigma	T8660	Dilución 1/1000
Agitador orbital MS, MS-NOR-30 (Agitador orbital)	Ciencia Mayor	MS-NRC-30
Neurobasal (Neurobasal)	Tecnologías de la Vida / Gibco	21103049	Mantenimiento y maduración de poblaciones de células neuronales embrionarias, listas para usar
Aminoácidos no esenciales (NEAA)	Gibco	11140	Aminoácidos no esenciales 100X, solución madre 100x, solución final 1x
Anticuerpo Nurr1 (M-196)	Santa Cruz	SC-5568	Dilución 1/100
Nutristem (medio hESC)	Industrias Biológicas	05-100-1A	Medios de células madre, listos para usar
Penicilina / Estreptomicina (Penicilina / Estreptomicina )	Tecnologías de la Vida / Gibco	15140122	Para cultivo celular, solución madre 5 mg/mL, solución final 50 μg/mL
Solución salina tamponada con fosfato sin Ca2+/Mg2+ (PBS sin Ca2+/Mg2+)	Tecnologías de la Vida	14190250	Para cultivo celular, listo para usar
Quinasa asociada a Rho Y-27632 (ROCK)	Abcam Bioquímicos	AB120129-1	Inhibidor de rocas, solución madre 50 mM en DMSO, solución final 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activina/Inhibidor ganglionar)	Ascenso	ASC- 163	Dual-Smad, solución madre de 50 mM en DMSO, solución final de 10 μM
StemPro Accutase (solución enzimática hESC)	Gibco	A11105-01	Solución enzimática hESC, lista para usar
Matraz T150 (matraz T150)	halcón	08-772-1F
Factores de crecimiento transformantes beta 3 (TGFβ3)	Guía de células	GFH109-2	Para el protocolo dopaminérgico, solución madre 100 μg/mL en etanol puro, solución final 1 ng/mL
Tripsina 0,25% (solución enzimática)	Tecnologías de la Vida	15050065	Solución enzimática, lista para usar
X-vivo (medio libre de suero)	Lonza	BE04-743Q	medio sin suero, listo para ti