Generación de organoides neuronales dopaminérgicos a partir de células madre embrionarias humanas

Resumen

Fuente: Cosset, E. et al. Organoides neuronales humanos para el estudio del cáncer cerebral y las enfermedades neurodegenerativas. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESCs) en neuronas dopaminérgicas, para proporcionar un modelo para el estudio de la enfermedad de Parkinson. Las hESCs se cultivan en un medio de inducción neural en una placa de micropocillos para formar neuroesferas 3D. A continuación, se cultivan en un medio de inducción neuronal para promover la diferenciación en neuronas progenitoras dopaminérgicas. La maduración final de las neuronas se produce en un inserto de cultivo en condiciones de interfaz aire-líquido, lo que da lugar a organoides 3D formados por neuronas dopaminérgicas maduras.

Protocolo

>1. Organoides dopaminérgicos derivados de hESC para estudios de la enfermedad de Parkinson (EP)

1. Día 0: Amplifique las hESC en cultivo 2D hasta un 60% de confluencia (día 0), luego reemplace los medios de células madre utilizados para mantener las características de pluripotencia de las hESC con un medio sin suero. Inicie la inducción neural suplementando el medio de cultivo con un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP) de 0,5 μM y un inhibidor del factor de crecimiento transformante beta (TGFβ)/Activina/Nodal de 10 μM (cóctel de inhibición de SMAD dual), luego agregue 10 μM de inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) durante 24 h para aumentar la tasa de supervivencia de las células durante el paso.
2. Día 1: Prepare la placa de micropocillos con 2,5 mL por pocillo de medio libre de suero suplementado con 0,5 μM de inhibidor de BMP, 10 μM de TGFβ/Activina/Inhibidor ganglionar y 10 μM de inhibidor de ROCK. Para especificar las células hacia el patrón ventral del tubo neural, agregue 100 ng/mL de erizo sónico (SHH), 100 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos 8 (FGF8) y 2 μM de agonista suavizado. Centrifugar la placa (solo con medio y sin celdas) a 1200 x g durante 5 min para eliminar las burbujas de aire de los micropocillos.
   1. Después de 1 día de inducción neural en 2D, retire el medio y lave rápidamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca²⁺/MgCl²⁺. Disociar las colonias en suspensión unicelular añadiendo 7,5 mL de solución enzimática recombinante en un matraz T75^cm2. Incubar durante 2 minutos a 37 °C y luego completar con 7,5 mL de la mezcla de medio/nutriente Eagle modificada F-12 (DMEM-F12) de Dulbecco.
   2. Recoja la suspensión celular y centrifugue a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y cuente las células en el mismo medio utilizado para preparar la placa de micropocillos.
   3. Ajuste el volumen del medio para obtener una suspensión celular que permita formar neuroesferas que contengan 1000 células por micropocillo (por ejemplo, la placa de micropocillos utilizada aquí contiene 4.700 micropocillos por pocillo). Por lo tanto, prepare 4,7 millones de células en 2,5 mL de medio y agréguelo a los 2,5 mL de medio anteriores ya colocados en el plato.
   4. Para distribuir correctamente las células en cada micropocillo, agite suavemente la placa y centrifugue la placa de micropocillo 300 x g durante 5 min. Incubar la placa a 37 °C durante 24 h para generar esferas.
3. Día 2: Enjuague suavemente los micropocillos con el medio y recoja y luego transfiera las esferas en una placa de seis pocillos tratada con tejido. Reemplace el medio con medio Neurobasal suplementado con 1% de B27, 1x aminoácidos no esenciales (NEAA), 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina. Además, agregue factores de regionalización SHH, FGF8, agonista suavizado y moléculas pequeñas de inhibición de SMAD dual.
   1. Colocar las esferas en rotación a 37 °C (60 rpm, agitador orbital) y cambiar el medio medio recién suplementado cada 2-3 días.
4. Día 3: Para mejorar la inducción neuronal y convertirla en progenitores neuronales con una identidad del mesencéfalo, complemente el medio con un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3 beta (GSK-3β) de 3 μM, que activa la vía Wnt/β-catenina. Mantener el inhibidor de GSK-3β en el medio hasta el día 13. Dividido en dos nuevas placas de 6 pocillos tratadas con tejido para reducir la densidad de esferas por pocillo y evitar la agregación de esferas.
   nota: En el día 8, la mayoría de las células deberían ser positivas para Nestin.
5. Día 8: Inicio de la maduración neuronal: sustitución de los factores de regionalización SHH, FGF8, agonista suavizado y cóctel de inhibición de doble SMAD por 0,5 mM de dibutiril monofosfato de adenosina cíclica (AMPc) (para favorecer la maduración), inhibidor de 20 nM de la histona desacetilasa (para la salida del ciclo celular), 1 μM de inhibidor de la γ-secretasa y factores de crecimiento, 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), 1 ng/mL de factor de crecimiento transformante β3 (TGFβ3) y 5 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos 20 (FGF20) (ambos favorecen la supervivencia de los progenitores dopaminérgicos [DA]). Cambie el medio cada 2-3 días.
6. Día 21: Generación del organoide neuronal: siembra alrededor de 100 neuroesferas en condiciones de interfaz aire-líquido en politetrafluoroetileno (membrana de PTFE, 6 mm de diámetro). Transfiera la membrana a un inserto de placa de cultivo (0,4 mm) y agregue 1,2 mL de medio de maduración neural utilizado para la diferenciación de la neurosfera como se describió anteriormente.
   1. Detenga cualquier rotación de este paso. Cambie el medio cada 2-3 días hasta que se alcance el punto de tiempo de diferenciación requerido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 6 pocillos (placa de 6 pocillos)	Halcón / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (Placas de cultivo de micropocillos)	Tecnologías StemCell	34421
Suplementos de B27 (B27)	Tecnologías de la Vida / Invitrogen	Año 1238	Para ambos protocolos, solución madre 100x, solución final 1x
Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)	Guía de células	GFH1-2	Para ambos protocolos, solución madre 100 μg/mL en H2O puro, solución final 20 ng/mL
CHIR-99021 (inhibidor de GSK-3β)	Axon Medchem	CT99021	Para el protocolo dopaminérgico, solución madre 7,5 mM en DMSO, solución final 3 μM
Compuesto E, un inhibidor de la γ-secretasa (inhibidor de la γ-secretasa)	Calbiochem	CAS 209986-17-4	Para ambos protocolos (inhibidor de la gamma-secretasa XXI), solución madre 5 mM en DMSO, solución final 1 μM
Dibutiril AMP cíclico (Dibutiril cAMP)	sigma	D0627	Para el protocolo dopaminérgico, solución madre 0,5 M en DMSO, solución final 0,5 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mix F-12 (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Para cultivo celular, listo para usar
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Tecnologías de la Vida	AM9912	Para cultivo celular, listo para usar
Factor de crecimiento de fibroblastos 20 (FGF20)	Peprotech	Págs. 100-41	Para el protocolo dopaminérgico, solución madre 100 μg/mL en H2O puro, solución final 5 ng/mL
factor de crecimiento de fibroblastos 8 (FGF8)	Peprotech	GFH176-5	Para el protocolo dopaminérgico, solución madre 100 μg/mL en H2O puro, solución final 100 ng/mL
Factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF)	Guía de células	GFH2-2	Para ambos protocolos, solución madre 100 μg/mL en H2O puro, solución final 20 ng/mL
Membrana hidrofílica de politetrafluoroetileno (membrana de PTFE)	Interfaz BioCell	terminado
LDN-193189 (inhibidor de BMP)	Axon Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, solución madre 5 mM en DMSO, solución final 0,5 μM
L-glutamina (L-glutamina)	Gibco	25030081	L-glutamina (200 mM), solución madre 200 mM, solución final 2 mM
Inserto de placa de cultivo Millicell-CM (0,4 μm) (Inserto de placa de cultivo)	Millipore	PICM03050
Agitador orbital MS, MS-NOR-30 (Agitador orbital)	Ciencia Mayor	MS-NRC-30
Suplementos de N2 (N2)	Invitrogen	17502-048	Para cultivo GIC, solución madre 100x, solución final 1x
Neurobasal (Neurobasal)	Tecnologías de la Vida / Gibco	21103049	Mantenimiento y maduración de poblaciones de células neuronales embrionarias, listas para usar
Aminoácidos no esenciales (NEAA)	Gibco	11140	Aminoácidos no esenciales 100X, solución madre 100x, solución final 1x
Nutristem (medio hESC)	Industrias Biológicas	05-100-1A	Medios de células madre, listos para usar
Penicilina / Estreptomicina (Penicilina / Estreptomicina )	Tecnologías de la Vida / Gibco	15140122	Para cultivo celular, solución madre 5 mg/mL, solución final 50 μg/mL
Solución salina tamponada con fosfato sin Ca2+/Mg2+ (PBS sin Ca2+/ Mg2+ )	Tecnologías de la Vida	14190250	Para cultivo celular, listo para usar
Purmorfamina (agonista suavizado)	Calbiochem	SML0868	Para el protocolo dopaminérgico, solución madre 10 mM en DMSO, solución final 2 μM
Quinasa asociada a Rho Y-27632 (ROCK)	Abcam Bioquímicos	AB120129-1	Inhibidor de rocas, solución madre 50 mM en DMSO, solución final 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activina/Inhibidor ganglionar)	Ascenso	ASC- 163	Dual-Smad, solución madre de 50 mM en DMSO, solución final de 10 μM
Erizo sónico (SHH)	Guía de células	GFH168-5	Para el protocolo dopaminérgico, solución madre 100 μg/mL en H2O puro, solución final 100 ng/mL
StemPro Accutase (solución enzimática hESC)	Gibco	A11105-01	Solución enzimática hESC, lista para usar
Matraz T150 (matraz T150)	halcón	08-772-1F
Factores de crecimiento transformantes beta 3 (TGFβ3)	Guía de células	GFH109-2	Para el protocolo dopaminérgico, solución madre 100 μg/mL en etanol puro, solución final 1 ng/mL
Trichostatina A (inhibidor de la histona desacetilasa)	sigma	T8552	Para el protocolo dopaminérgico, solución madre 100 μM en DMSO, solución final 20 nM
TrypLE (solución enzimática recombinante)	Invitrogen	12604021	Solución enzimática recombinante, lista para usar
Tripsina 0,25% (solución enzimática)	Tecnologías de la Vida	15050065	Solución enzimática, lista para usar
X-vivo (medio libre de suero)	Lonza	BE04-743Q	medio sin suero, listo para usar