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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Cateterismo arterial
- Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina y un analgésico de acuerdo con la práctica local (por ejemplo, buprenorfina). Pellizque las extremidades traseras con pinzas para confirmar la profundidad correcta de la anestesia.
nota: Para este estudio, se utilizaron ratones machos C57BL/6N a la edad de 8-12 semanas (peso 20-25 g). Los autores han probado sin éxito el BALB/c masculino de la misma edad, pero no han probado otras cepas.
- Retire el vello en las regiones de interés (cabeza, cuello) con una maquinilla de afeitar eléctrica. Asegúrese de que no quede pelo suelto para evitar la contaminación de la herida. Posteriormente, desinfectar el campo quirúrgico con etanol/clorhexidina/betadine al 70% y colocar al ratón en decúbito supino con la cabeza hacia el cirujano.
- Haga una incisión en la línea media cervical con tijeras de disección.
- Diseccionar las glándulas submandibulares y el tejido muscular del cuello y separarlos para exponer la arteria carótida común. Utilice principalmente la disección roma con fórceps.
- Lugar tres 8-0 ligaduras de seda debajo de la arteria carótida común derecha.
- Coloque una pinza en la ligadura proximal y lleve la tensión a la arteria para que el flujo quede suspendido.
- Cierre la ligadura más distal.
- Inserte el catéter arterial a través de un pequeño orificio de piel preformado en la cara craneal de la incisión. Apriete y deforme la luz del catéter si parece demasiado grande para reducir el reflujo sanguíneo. Fíjate con las tres ligaduras.
- Fije el catéter a la piel para evitar la dislocación. Para ello, utilice una sutura (por ejemplo, monofilamento 5-0, no absorbible) que conecte el catéter a la piel en la zona del orificio cutáneo preformado.
>2. Traqueostomía
- Diseccionar la musculatura pretraqueal sin rodeos con fórceps.
- Lugar dos 8-0 ligaduras de seda debajo de la tráquea.
- Traqueotomizar con microtijeras lo más proximalmente posible para evitar la ventilación unilateral. Use una línea de corte horizontal entre dos cartílagos traqueales.
- Inserte el tubo de ventilación y fíjelo con ambas ligaduras preparadas.
nota: El extremo proximal de la tráquea no necesita ser ligado.
- Cierre la piel con una sutura corrida (p. ej., monofilamento 6-0, no absorbible).
- Ventile el ratón con una frecuencia de 150/min y un volumen corriente de 200 μL.
>3. Inducción de la muerte encefálica (BD)
- Coloque el ratón en posición prona.
- Retire la piel del cráneo con tijeras quirúrgicas y pinzas para sujetar la piel.
- Taladre un orificio de calibre 1 mm paramedialmente por encima de la corteza parietal izquierda. Deje de perforar antes de romper el hueso compacto interno y la duramadre.
- Penetre el puente de tejido final del cráneo con pinzas romas, eliminando los bordes afilados.
- Inserte el catéter con balón, de modo que quede completamente dentro de la cavidad craneal. Asegúrese de que el globo esté precargado con solución salina y de que se haya evacuado todo el aire.
- Comience a inflar a ~0.1 mL/min durante un período de 10-15 min (volumen total de 0.8-1.2 mL) con la ayuda de una bomba de jeringa.
nota: El ratón exhibirá mioclonía, midriasis, más actividad convulsiva y jadeos agónicos.
- Pronuncia la muerte cerebral del ratón una vez que la cola del ratón se ha endurecido y se ha erigido.
nota: La EB se confirma por un pico de presión arterial inicial característico (reflejo de Cushing), la ausencia de reflejos del tronco encefálico y la respiración espontánea. Las pruebas regulares de apnea deben evitarse durante los experimentos, ya que los ratones pueden volverse circulatoriamente inestables debido a la falta de oxígeno.
- Detenga el inflado del catéter con balón.
- Coloque una manta térmica sobre el ratón para evitar la hipotermia.