NOTA: Las líneas transgénicas utilizadas en este estudio incluyen el linaje específico de macrófagos mpeg1:mCherry (construido internamente), mpo específico de neutrófilos: GFP, gata1:dsRed específico de eritroides y ubiq:secAnnexinV-mVenus, un reportero de la muerte celular (rederivado internamente) en fondos de tipo salvaje, nácar (mitfaw2/w2) y mutantes (bbhm292).
1. Día 0: Producción y recolección de huevos
- Recoja embriones fertilizados del desove natural en cajas de cría producidas a partir de 1 pez cebra adulto macho y 1-2 hembras.
nota: Para el protocolo de atorvastatina, se puede utilizar cualquier animal de tipo salvaje/transgénico; Sin embargo, las tasas de hemorragia difieren ligeramente entre las cepas.
- Incubar 100 embriones a 28 °C en medio embrionario E3 estándar por placa de Petri y etapa de acuerdo con las pautas estándar.
- A las ~6 horas después de la fertilización (hpf), retire los embriones muertos y no fertilizados de la placa con una pipeta Pasteur. La Figura 1 muestra la línea de tiempo experimental.
>2. Día 1: Tratamiento con atorvastatina a 24 hpf
- Embriones de decorionado para el tratamiento con atorvastatina utilizando pinzas de disección afiladas y ultrafinas. Los números necesarios para la experimentación se pueden ajustar en consecuencia.
- Agregue 30 mL de medio embrionario E3 a dos placas de Petri limpias. Use un plato para 100 embriones.
nota: Si las placas están diseñadas para el cultivo celular, el pez cebra decorionado en esta etapa temprana a menudo se adhiere al fondo. Para evitar esto, enjuague bien las placas con agua limpia antes de usarlas.
- Retire 60 μL de agua de embriones de la placa de tratamiento y agregue 60 μL de atorvastatina (ATV) 0,5 mM. A una concentración de stock de 0,5 mM, la dilución anterior dará como resultado una concentración final de 1 μM, lo que dará como resultado ~20% de larvas sin hemorragia (ICH-) y ~80% de larvas con hemorragia (ICH+). Utilice la otra placa para los controles no tratados.
nota: La atorvastatina se solubiliza en agua destilada (3 mg en 10 mL) para formar una solución madre de 0,5 mM. Incubar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación, ya que la solubilización lleva algún tiempo. La solubilización completa puede tardar hasta 1 semana. No use DMSO (dimetilsulfóxido). La solución se alícuota y se almacena a -20 °C. No congelar ni descongelar.
- Con una pipeta Pasteur, transfiera 100 embriones con la menor cantidad de agua posible a las placas de tratamiento.
- Incubar las placas a 28 °C.
nota: La HIC (hemorragia intracerebral) se producirá entre los 33 y los 48 hpf. No es necesario eliminar la atorvastatina, ya que la incubación de más de 24 horas no causa más problemas de desarrollo.
3. Día 2: Separación de las poblaciones de ICH- e ICH+ a 50 hpf
- Separe los peces ICH+ de las poblaciones ICH- y transfiéralos a nuevos platos para mayor facilidad.
- Si se utiliza el modelo ATV a una concentración de 1 μM, el 75-100% de las larvas presentarán hemorragia (ICH+) en este momento
nota: La respuesta de las larvas difiere entre las cepas, si las larvas no tienen hemorragias con la frecuencia deseada, use un lote fresco de atorvastatina o una concentración más alta. Si las larvas no han mostrado hemorragia a las 48 hpf, entonces considérelas ICH-.
- Si se utiliza el modelo bbh, todos los mutantes homocigotos presentarán una hemorragia de 48 hpf. Si se utiliza un cruzamiento heterocigótico, los hermanos heterocigotos ICH y de tipo salvaje pueden utilizarse como animales de control para experimentos.
- Si es necesario, anestesiar las larvas añadiendo MS222 al 0,02% al medio E3. Con una pipeta Pasteur, clasifique las larvas en busca de sangre en la cabeza en medios E3 frescos. Ver Figura 2.
nota: La sangre en la cabeza puede aparecer en el cerebro anterior, medio o posterior o en combinación, y el volumen de la hemorragia puede variar entre los animales. En los mutantes bbh, la ICH a menudo se asocia con edema severo, que es reconocible por cabezas más grandes, espacio más amplio entre los ojos y un sangrado más difuso. Sin embargo, no todas las larvas de ICH+ bbh presentan edema.
