Tinción inmunofluorescente de sialoglicoproteínas en células progenitoras neurales y neuronas

Resumen

Fuente: Bai, Q., et al., Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neurales primarias y progenitoras mediante el marcaje metabólico de sialoglicano. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra la biotinilación y el marcaje fluorescente de sialoglicoproteínas modificadas en células madre y progenitoras neurales primarias, así como neuronas, y su visualización mediante microscopía de fluorescencia.

Protocolo

>1. Tinción inmunofluorescente de sialoglycoproteínas en NSPCs primarias expandidas y neuronas diferenciadas

1. Prepare BTTAA-CuSO₄ complex 1 30x stock que contenga 1,5 mM de CuSO₄ y 9 mM de BTTAA en agua bidestilada. Prepare el tampón 1 recién conjugado con biotina que contiene 50 μM de biotina-alquino, 2,5 mM de ascorbato de sodio y 1x complejo BTTAA-CuSO₄ en PBS.
2. Retire los insertos de las placas de cocultivo. Aspire el medio de cultivo de los pocillos inferiores y lave las células neurales una vez con PBS precalentado.
3. Aspire el PBS de los pozos. Agregue 1 mL de solución de PBS de paraformaldehído al 4% preenfriada por pocillo a las celdas y fíjelas en RT durante 10 min. Luego, lave las celdas 3 veces con PBS preenfriado.
4. Aspire el PBS de los pocillos y agregue 1 mL de tampón conjugado con biotina recién preparado 1 por pocillo en las células. Incubar las células en RT durante 10 min.
5. Aspire el tampón de reacción de los pocillos. Lave las celdas 3 veces con PBS. Prepare el tampón de tinción que contiene 1% de FBS y 1 μg/mL de Alexa Fluor 647-estreptavidina. Agregue 1 mL de tampón de tinción por pocillo en las células e incube las células en RT durante 30 min.
6. Aspire el tampón de tinción de los pocillos y lave las celdas 3 veces con PBS preenfriado. Prepare el tampón de bloqueo que contiene 5% de BSA y 0,3% de detergente no iónico-100 en PBS. Agregue 1 mL de tampón de bloqueo por pocillo en las celdas e incube a RT durante 10 min.
7. Prepare una solución de anticuerpos primarios diluyendo los anticuerpos anti-nestina y anti-β-tubulina III juntos en el tampón de bloqueo en proporciones de 1:20 y 1:1.000, respectivamente. Retire el tampón de bloqueo de los pocillos y agregue 1 mL de solución de anticuerpos primarios por pocillo en las células. Incubar las células a 4 °C durante la noche.
8. Retire la solución de anticuerpos primarios de los pocillos. Lave las celdas 3 veces con PBS preenfriado. Prepare una solución de anticuerpos secundarios diluyendo Alexa Fluor 488 goatat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 546 goatat anti-mouse IgG2b y DAPI juntos en un tampón de bloqueo a una dilución de 1:1,000. Aspire el PBS de los pocillos y agregue 1 ml de solución de anticuerpos secundarios por pocillo en las células. Incubar las células en RT durante 2 h.
9. Aspire la solución de anticuerpos de los pocillos y lave las células 3 veces con PBS preenfriado. Después, las celdas están listas para la captura de imágenes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suero fetal bovino	Gibco	10099141	10%
Paraformaldehido	sigma	158127	4%
DAPI	Gibco	62248
Placa de 6 pocillos	Corning	3335
Monoclonal de ratón anti-Nestin	Estudio del Desarrollo Banco de Hibridomas	Rata-401	De 1 a 20
Anti-beta-tubulina III monoclonal de ratón	sigma	T8860	De 1 a 1000
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG1	Invitrogen	A-21121	De 1 a 1000
Alexa Fluor 546 cabra anti-ratón IgG2b	Invitrogen	A-21143	De 1 a 1000
Tritón X-100	Amresco	694
Sulfato de cobre	sigma	209198
Alquino-biotina	Haga clic en Herramientas de química	TA105
BTTAA	Haga clic en Herramientas de química	Año 1236
ascorbato de sodio	sigma	A4034
Alexa Flour 647-estreptavidina conjugada	Invitrogen	S21374	De 1 a 1000