Evaluación in vitro de la β amiloide agregada en el colapso del cono de crecimiento neuronal

Resumen

Fuente: Kuboyama, T. Visualizando el colapso del cono de crecimiento axonal y los efectos tempranos del β amiloide en neuronas de ratón cultivadas. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra una evaluación in vitro del colapso del cono de crecimiento neuronal por agregados de β de amiloide (Aβ). El tratamiento de las neuronas con agregados Aβ provoca la desestabilización del citoesqueleto, lo que provoca el colapso de los conos de crecimiento en la punta de los axones. Las células tratadas se comparan con las células de control para evaluar el grado de colapso del cono de crecimiento.

Protocolo

1. Ensayo de colapso

1. Recubrimiento de poli-D-lisina
   1. Cubrir los portaobjetos de cultivo de 8 pocillos con 400 μL de 5 μg/mL de poli-D-lisina (PDL) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubarlos a 37 °C durante la noche.
   2. Retire la solución de PDL y lave los pocillos 3 veces con agua destilada.
2. Cultivo de neuronas
   1. Picar cortezas cerebrales recién aisladas de ratones embrionarios día 14 (E14) ddY (Deutschland, Denken y Yoken) con microtijeras en medio de cultivo de neuronas que contenía 12% de suero de caballo, 0,6% de glucosa y 2 mM de L-glutamina (medio A). No agregue antibióticos.
      nota: En este protocolo, se utiliza el ratón ddY. Esta es una cepa endogámica comúnmente utilizada en Japón. Este protocolo de cultivo de neuronas también se puede aplicar para neuronas corticales de rata.
   2. Centrifugar los tejidos a 87 x g durante 3 min.
   3. Retire el sobrenadante. A continuación, añadir 2 mL de tripsina al 0,05% e incubar durante 15 min a 37°C. Mezclar dando golpecitos cada 5 min.
   4. Añadir 4 mL de medio A y mezclar dando golpecitos.
   5. Centrifugar los tejidos a 178 x g durante 3 min.
   6. Retirar el sobrenadante e incubar los tejidos con 600 U/mL de desoxirribonucleasa I (DNasa I) y 0,3 mg/mL de inhibidor de tripsina de soja disueltos en PBS durante 15 min a 37 °C. Mezclar dando golpecitos cada 5 min.
   7. Después de la incubación, agregue 4 mL de medio A y mezcle dando golpecitos.
   8. Centrifugar los tejidos a 178 x g durante 3 min.
   9. Después de retirar el sobrenadante, añadir 4 mL de medio A y triturar los tejidos con una pipeta Pasteur pulida.
   10. Filtrar los tejidos triturados con una malla de 70 μm del tamaño de un poro. Después de la filtración, calcule la densidad de células con un hemocitómetro.
   11. Cultive las células en el portaobjetos de cultivo de 8 pocillos a 0,8 x 10⁴ células/pocillo con medio A y manténgalas en una incubadora de CO₂ con una atmósfera humidificada de 10% de CO₂ a 37 °C.
   12. Después de 4 h de cultivo, reemplace el medio de cultivo por uno que contenga un 2% de suplemento para cultivo neuronal, 0,6% de glucosa y 2 mM de L-glutamina (medio B).
       nota: La pureza de las neuronas fue de aproximadamente el 75%, como se describió anteriormente.
3. Ensayo de colapso
   1. Disolver el amiloide β1-42 (Aβ1-42) obtenido comercialmente en agua destilada a una concentración de 0,5 mM e incubar a 37 °C durante 7 días. Después de la incubación, almacene la solución agregada de Aβ1-42 en un congelador a -30 °C hasta su uso.
      nota: Esta incubación es necesaria para la agregación y toxicidad del Aβ.
   2. Después de 4 días de cultivo neuronal, tratar los pocillos con 100 μL de nuevo medio B, que contiene 0,5 μM de Aβ1-42 agregado o solución vehicular (agua destilada) durante 1 h.
      nota: Los efectos de Aβ1-42 se incrementaron en función de la dosis de 0,1 a 5 μM y alcanzaron un máximo de 0,5 μM como se describió anteriormente. Se pueden observar resultados similares cuando se administra un tratamiento con Aβ1-42 durante 1 h después de 3 días de cultivo neuronal.
   3. Retire el medio de cultivo y fije inmediatamente las neuronas con paraformaldehído al 4% y sacarosa al 4% en PBS durante 1 h a 37 °C en una placa caliente.
   4. Después de la fijación, lavar las neuronas 3 veces con PBS y montarlas con un medio de montaje acuoso. Seque el medio de montaje a 4 °C durante 2-4 días.
   5. Capture toda el área (7,8 x 9 mm²) de cada pocillo con una lente de objetivo seco 20X en un microscopio invertido.
   6. Clasificar las neuritas más largas de cada neurona en la etapa 3 o 4 como axones, como se describió anteriormente.
   7. Clasifique los conos de crecimiento de acuerdo con los siguientes criterios: 1) los conos de crecimiento axonales que carecen de lamelipodios o 2) que poseen menos de tres filopodios se consideran conos de crecimiento colapsados, como se describió anteriormente
      nota: Los conos de crecimiento saludables se puntúan como 0 puntos; Los conos de crecimiento colapsados se puntúan como 1 punto. Se calculan las puntuaciones medias de colapso para cada tratamiento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones ddY	Slc
Tobogán de cultivo de ocho pozos	halcón	354108
lisina poli D	Wako	168-19041
Medio de cultivo, Medio neurobasal	Gibco	21103-049
Sérum de la casa	Gibco	26050-088
glucosa	Wako	049-31165
L-glutamina	Wako	074-00522
0,05% de tripsina	Gibco	25300-054
DNasa I	Worthington	Dp
Inhibidor de la tripsina de la soja	Gibco	17075-029
Filtro con tamaño de malla de 70 μm, filtro de células	halcón	352350
Suplemento B-27	Gibco	17504-044
Incubadora deCO2	Astec	SCA-165DS
Amiloide β1-42	Sigma-Aldrich	A9810
Paraformaldehido	Wako	162-16065
sacarosa	Wako	196-00015
Medio de montaje acuoso, AquaPoly/Mount	Policiencias	18606-20
Microscopio invertido A	Carl Zeiss	Axio Observador Z1	Conectado con AxioCam MRm, unidad de calefacción XL S, módulo de CO2 S1 y TempModule S1
Objetivo Plan-Apochromat 20x	Carl Zeiss	420650-9901