Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Preparación de secciones de tejido para espectrometría de masas por imagen (IMS)
- Procesamiento de una muestra de tejido de un cerebro humano autopsiado
nota: Asegúrese de que el paso de preparación de la muestra para IMS conserve el estado original del tejido. Evite la contaminación y los cambios post mortem. El siguiente paso es crucial.
- Obtenga muestras corticales humanas para IMS de cerebros que se extrajeron, procesaron y almacenaron a -80 °C dentro de las 8 h postmortem. Tome la muestra de cerebro de la corteza occipital de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA) y controles de la misma edad.
- Preparación de secciones de tejido congelado
- Corta las secciones de tejido en un criostato. Coloque portaobjetos de vidrio de microscopio recubiertos de óxido de indio y estaño (ITO) conductores dentro del criostato.
- Calentar la muestra de cerebro de la autopsia de -80 °C a -22 °C dentro del criostato.
- Coloque una nueva cuchilla desechable en el criostato para cada experimento. Trate siempre de usar una parte limpia de la hoja.
- Coloque los cerebros de autopsia congelados en el escenario junto con una pequeña cantidad de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (suficiente para cubrir el área central del escenario; consulte la Tabla de materiales).
- Elija las condiciones para el corte fino. Para IMS, utilice un grosor de 10-12 μm para las secciones de cerebro humano. Para IMS e inmunohistoquímica (IHQ), corte de cinco a seis secciones de cada muestra de tejido.
- Cuando la cuchilla esté empezando a cortar el tejido, gire la rueda y "enfrente" el bloque hasta que todo el tejido quede expuesto. Si hay una pequeña raya o desgarro en la sección, espere un poco más en el criostato hasta que el ajuste de temperatura lo arregle automáticamente. Cuente unos segundos antes de abrir el antivuelco con un pañuelo debajo.
- Coloque inmediatamente la rebanada de pañuelo en el lado recubierto de ITO del portaobjetos de vidrio. Descongele la rebanada de tejido colocando un dedo debajo del portaobjetos en el lado no recubierto de ITO. El pañuelo se pegará al portaobjetos; Asegúrese de que el tejido sea lo más plano posible sin arrugas. Realice este paso a temperatura ambiente.
nota: Use guantes, mascarillas y una bata de laboratorio porque las muestras humanas pueden contener contaminantes biológicos. Cuando se hayan hecho todas las secciones del día, limpie el criostato, los cepillos y los mandriles con toallitas de laboratorio y 200 ml de etanol al 100%.
- Enjuague de las secciones de tejido
- Sumerja las muestras en 40-100 ml de etanol al 70% durante 30 s para eliminar los lípidos endógenos y las sales inorgánicas. Usa un frasco de vidrio para teñir.
- Lave las muestras con 40-100 mL de etanol al 100% durante 30 s, 40-100 mL de solución de Carnoy durante 3 min, 40-100 mL de etanol al 100% durante 30 s, 40-100 mL de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% durante 1 min y 40-100 mL de etanol al 100% durante 30 s. Utilice un frasco de vidrio para tintar.
nota: La solución de Carnoy es un fijador compuesto por seis partes de etanol, tres partes de ácido acético y una parte de cloroformo.
- Secar al vacío durante 30 min.
- Tratamiento de las secciones de tejido con vapor de ácido fórmico para una mejor ionización de las proteínas Aβ de los tejidos cerebrales de la autopsia
- Preparar el horno y el portaobjetos de vidrio de incubación que se utilizarán para la posterior vaporización con 5 mL de ácido fórmico 100%. Para lograr un tratamiento ácido satisfactorio, mantenga la humedad del aire en el plato de vidrio de incubación a un nivel de saturación durante todo este paso y mantenga la temperatura a 60 °C. Coloque los portaobjetos de tejido en el plato de vidrio de incubación evitando la inmersión en el ácido fórmico y trate durante 6 min.
- Tome una imagen óptica de las muestras utilizando un escáner de película, un escáner de gel, un microscopio digital, etc. Realice este paso a temperatura ambiente. La alineación de la imagen óptica de las muestras es necesaria cuando el objetivo de la muestra se coloca dentro del instrumento. Por lo general, no será posible reconocer la sección de tejido debajo de la capa de la matriz.
NOTA: La forma más conveniente de tomar una imagen óptica es usar un escáner de oficina. Es una buena idea guardar la imagen en la carpeta de almacenamiento de datos de imágenes.
- Para correlacionar las imágenes ópticas con las muestras, haga marcas guía que sean visibles tanto en la imagen óptica como debajo de la capa de matriz en la óptica de la cámara. La forma más fácil es detectar al menos tres marcas de líquido corrector alrededor de la muestra antes de tomar la imagen óptica.
- Aplicación matricial
- Preparación de la solución matricial
- En un microtubo orgánico tolerante a disolventes, prepare una solución de 10 mg/ml de ácido sinapínico (SA) en acetonitrilo (ACN) al 50% y TFA al 0,1%. Disuelva completamente el compuesto SA mediante vórtice o sonicación breve durante 10 min. Guarde la solución a temperatura ambiente hasta su uso.
NOTA: Hay tres opciones diferentes para la pulverización de matriz: utilizando un aerógrafo, un pulverizador ultrasónico o un pulverizador automático.
- Pulverizar la matriz con un aerógrafo
- Realice la operación a una temperatura ambiente constante (20-23 °C) y humedad (40%-60%). Los parámetros que se deben ajustar para una pulverización óptima incluyen el tamaño de la gota, la cantidad de niebla, el ángulo y la distancia entre la boquilla de pulverización y la sección de tejido, y la temperatura y la humedad del laboratorio. Ajuste estas condiciones comprobando los resultados de la microscopía.
nota: Dado que los factores limitantes incluyen el tamaño de los cristales y la homogeneidad de la cobertura de la matriz y la migración/difusión indeseable de los analitos, cuanto más pequeño, mejor para el tamaño de la gota. La homogeneidad es también el punto de inspección.
- Pulverización de la matriz con un pulverizador ultrasónico
- Retire el pañuelo a rociar del desecador y colóquelo en la cámara. Asegúrese de que el pañuelo no cubra la ventana del sensor.
- Comience la preparación presionando el botón Inicio; por lo general, el tiempo de preparación es de alrededor de 90 minutos. La preparación se regulará automáticamente mediante el control del espesor y la humedad de la capa de la matriz. Una vez completada la preparación, retire la diapositiva y guárdela en el desecador durante 15 minutos antes de leerla en el instrumento MALDI.
- Limpie el rociador con 2-3 mL de metanol al 100% (MeOH) hasta que el cabezal rociador parezca limpio.
nota: Una fina niebla de gotas de matriz se deja hundir en el tejido por una lámina gravitacional. Se genera un tamaño medio de gota de 20 μm; Todos los diámetros de gota son inferiores a 50 μm.
- Pulverización de la matriz con un pulverizador automático
- Rocíe la solución de matriz sobre la superficie del tejido con un rociador automático. Se suministrará un flujo constante de gas de vaina calentado (N2, ajustado a 10 psi y 75 °C) junto con la pulverización de la solución de matriz. Utilice un sistema de bomba de solvente (ajustado a 10 psi y 0,15 mL/min) para administrar la solución de matriz.
nota: Lo más importante es trabajar debajo de una cabina de seguridad para evitar cualquier inhalación de aerosoles de matriz. Controle la temperatura y la humedad ambiente para reproducir una cristalización homogénea de la matriz.
>2. MALDI-IMS
- Realice espectrometría de masas de ultra alta velocidad.
- Realice experimentos de imágenes de alto rendimiento y alta resolución espacial con MALDI-IMS equipado con un láser de granate de itrio y aluminio dopado con neodimio de 10 kHz (Nd:YAG, 355 nm).
- Para las mediciones de espectrometría de masas, defina las áreas de tejido utilizando el software de control MALDI y el software de análisis de datos.
- Adquiera espectros en modo lineal positivo con un rango de masas de m/z de 2.000 a 20.000 y una resolución espacial de 20 y 100 μm.
- Para hacer el patrón de calibración, disuelva el patrón de calibración de péptidos y el patrón de calibración de proteínas con una proporción de 1:4 con ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinámico (CHCA) en una solución TA30 (ACN: 0,1% TFA = 30:70) y luego diluya 10 veces. Coloque 1 μL de patrón de calibración en el portaobjetos en cuatro ubicaciones diferentes.
- Utilizando software de histología molecular (ver Tabla de Materiales), superponga múltiples imágenes individuales para encontrar la correlación espacial de varias señales, como diferentes péptidos Aβ que se colocalizan en placas seniles (SP) y paredes arteriales.
