Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Materiales
- Preparación de la inyección de lipopolisacárido (LPS)
- Añadir 25 mL de agua destilada a 25 mg de polvo de LPS derivado de Salmonella typhimurium hasta una concentración final de 1 mg/mL. Almacene la inyección en un tubo estéril a 4 °C.
cautela: El LPS es tóxico.
- Prepare una solución de azul de Evans (EB) al 2% en una solución salina normal al 0,9% para mantener la inyección de EB en la concentración de trabajo.
2. Animales
Administrar LPS a ratas macho Sprague-Dawley (SD), de 10 semanas de edad (peso promedio: 280 ± 20 g) por inyección intraperitoneal.
cautela: Si las ratas se compran en otra organización, la fase de adaptación no debe ser inferior a 7 días.
>3. Inyecciones de LPS
- Inyectar LPS por vía intraperitoneal en cada rata a una dosis de 1 mg/kg y devolver las ratas a su jaula de origen.
nota: La anestesia no es necesaria.
- Seis horas más tarde, inyecte la misma dosis de inyección de LPS en las ratas.
- Dieciséis horas más tarde, inyecte la misma dosis de LPS en las ratas.
cautela: La inyección de LPS en ratas SD a una dosis de 1 mg/kg puede dar lugar a una tasa de mortalidad del 5%. La tasa de mortalidad podría aumentar aún más en ratas más jóvenes o viejas o en ratas hembras preñadas.
- Regrese a las ratas a sus jaulas después de la inyección de LPS y proporcione acceso ad libitum a la comida y la bebida.
nota: Las ratas exhibirán una respuesta inflamatoria sistémica distinta y, por lo tanto, es esencial que las jaulas permanezcan limpias durante todo el experimento. Las ratas deben ser monitoreadas con frecuencia (2 veces al día) para determinar el peso, la apariencia general y la actitud después de la primera inyección de LPS. Si las ratas comienzan a exhibir una postura encorvada, falta de voluntad para moverse, pérdida de peso significativa (>20%), tinción de porfirina para que sean sacrificadas humanamente antes del punto final del estudio EB de 7 días.
>4. Recogida de muestras
- Inyección EB
- Siete días después de la primera inyección, anestesiar a la rata por vía intraperitoneal de acuerdo con el protocolo aprobado de la IACUC.
- Espere de 1 a 2 minutos hasta que las ratas no muestren respuestas reflejas corneales. Realizar una punción cardíaca de 5 a 8 mm de profundidad en cada rata; El punto de punción debe estar a 5 mm del margen izquierdo del esternón en el 3º y 4º espacio intercostal.
- Esperar hasta que se observe la recuperación de la sangre y luego inyectar EB a una dosis de 0,2 mL/100 g de peso corporal en el ventrículo izquierdo >
cautela: La punción cardíaca y la inyección de EB deben realizarse cuidadosamente. La EB puede inyectarse en la cavidad torácica o el pericardio en lugar del ventrículo izquierdo del corazón.
- Succionar con un tubo vacío y reemplazar este volumen con un tubo EB antes de la inyección para ayudar a reducir la tasa de fallas (p. ej., inyección a la caja torácica por error).
- Mantenga a la rata en posición supina durante 10 min.
NOTA: Si la muestra no se utiliza para detectar fugas de EB en imágenes de inmunofluorescencia, se puede omitir este paso.
- Observación burda
- Realice perfusiones cardíacas utilizando solución salina tampón de fosfato 1 M (PBS) helada para despejar la vasculatura cerebral y el cerebro.
- Con un bisturí, haga una incisión abdominal a lo largo de todo el diafragma.
- Corta a través de las costillas justo a la izquierda de la línea media de la caja torácica.
- Abre la cavidad torácica. Use pinzas para exponer el corazón y facilitar el drenaje de sangre y otros líquidos.
- Mientras sostiene firmemente el corazón con fórceps (el corazón aún debe estar latiendo), inserte directamente una aguja en la protuberancia del ventrículo izquierdo para extenderla a unos 5 mm. Asegure la aguja en esa posición sujetándola cerca del punto de entrada
cautela: No extienda excesivamente la aguja, ya que puede perforar la pared interior y comprometer la circulación de las soluciones.
- Suelte la válvula para permitir que la solución de PBS helada fluya (200-300 mL) a una velocidad lenta y constante a alrededor de 20 mL/min utilizando una bomba de perfusión. Si los animales requieren fijación en lugar de observación macroscópica, utilice la misma dosis de solución salina helada al 0,9%.
- Con unas tijeras afiladas, haga una incisión en la aurícula, asegurándose de que la solución fluya continuamente. Si el líquido no fluye libremente o proviene de las fosas nasales o la boca del animal, vuelva a colocar la aguja.
- Cribado de CMHs por observación bruta.
nota: Si la muestra no se utiliza para calcular el número de CMH mediante observación macroscópica, se puede omitir este paso.
- fijación
- Realizar perfusiones cardíacas con una solución salina helada al 0,9 % (200-300 ml) para despejar la vasculatura cerebral y el cerebro.
- Realizar perfusiones cardíacas utilizando paraformaldehído al 4% helado para la fijación.
- Decapitar a la rata, aislar el cerebro y sumergir el cerebro en una solución de sacarosa al 20% durante al menos 6 h.
- Cambie la solución a sacarosa al 30% y fije por otras 6 h.
- Prepare secciones de tejido cerebral de 10 mm de espesor con un criostato.
>5. Tinción de hematoxilina y eosina (HE)
NOTA: Este procedimiento se realiza utilizando un kit de tinción HE.
- Lave los portaobjetos con agua destilada.
- Manchar en solución de hematoxilina durante 8 min. Lavar con agua corriente del grifo durante 5 min.
- Diferenciar en alcohol ácido al 1% durante 30 s. Lavar con agua corriente del grifo durante 1 min.
- Teñir con agua amoniacal al 0,2% (azulado) o solución saturada de carbonato de litio durante 30 s a 1 min. Lavar con agua corriente del grifo durante 5 min.
- Enjuague con alcohol al 95% (10 salsas).
- Contratinción con solución de eosina durante 30 s a 1 min.
- Deshidratar a través de alcohol al 95%, dos cambios de alcohol absoluto, durante 5 min cada uno.
- Transparente en xileno durante 30 s.
- Monta usando el método de Liu.
- Analice utilizando un microscopio de fluorescencia de campo claro.
nota: Los glóbulos rojos liberados de los vasos sanguíneos, que son los componentes de las CMH, aparecen en rojo anaranjado bajo la tinción HE.
