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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Cultivo primario de células del hipocampo
- Preparar el cultivo celular disociado del hipocampo de rata en el día embrionario 19. Coloque las celdas en cubreobjetos de 12 mm recubiertos con polietileno (PEI) en placas de 24 pocillos a una densidad de 50.000 a 60.000 celdas/pocillo. Compruebe la densidad mediante una cámara de recuento de células y una óptica de contraste de fase.
- Cultivar las neuronas durante 3 días (día in vitro (DIV) 3) en una placa de 24 pocillos en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
- Evalúe los cubreobjetos en busca de indicadores de la salud celular utilizando microscopía de luz transmitida (por ejemplo, óptica de contraste de fase con un aumento de 10 a 20X). Compruebe los siguientes indicadores de buena salud: un halo de contraste de fase claro, neuritas sin estructuras con cuentas y sin agrupamiento de somas o agrupaciones de neuritas.
>2. Transfección
NOTA: El siguiente protocolo se refiere a una doble transfección para 3 pozos. Sin embargo, el protocolo funciona mejor cuando se preparan cantidades suficientes para 4 pozos.
- Preparar 500 mL de tampón de transfección (274 mM de cloruro de sodio, NaCl, 10 mM de cloruro de potasio, KCl, 1,4 mM de hidrogeno fosfato disódico, Na2HPO4, 15 mM de glucosa, 42 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetinasulfónico, HEPES) en un matraz Erlenmeyer.
- Disolver 8,0 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na2HPO4, 1,35 g de glucosa y 5,0 g de HEPES en 400 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer.
- Ajuste el pH a 6,95 con hidróxido de sodio 1 M, NaOH usando un medidor de pH.
- Ajuste el volumen con agua destilada a 500 mL y verifique el pH con un medidor de pH.
- Realice 20 - 30 mL de alícuotas de tampón de transfección con los siguientes valores de pH pipeteando 1 M de NaOH en el tampón de transfección: 6,96, 6,97, 6,98, 6,99, 7,00, 7,01, 7,02, 7,03, 7,04, 7,05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7,11.
NOTA: El pH del tampón de transfección es crucial para la eficacia de la transfección.
- Para probar qué tampón de transfección conduce al mayor número de células transfectadas, pruebe cada valor de pH de 6,96 a 7,11. Utilice el método de transfección descrito en 2.2 - 2.11 y un plásmido validado que exprese proteína verde fluorescente (GFP). Determine el número de células transfectadas por cubreobjetos para cada valor de pH del tampón de transfección para evaluar qué tampón funciona mejor.
- Alícuota del tampón con la mayor eficiencia de transfección en tubos de microcentrífuga de 2 mL Congele y almacene los tubos a -20 °C.
- Precalentar el medio sérico reducido, el medio de cultivo celular y el agua destilada a 37 °C en el baño de agua.
- Prepare la mezcla de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Trabaje bajo la campana de flujo laminar para garantizar condiciones de trabajo estériles.
- Mezclar 7,5 μL de cloruro de calcio 2 M con 4 μg de cada ADN libre de endotoxinas (Sinaptofisina-mOrange y mGFP/GFP-Rogdi). Agregue agua para alcanzar un volumen total de 60 μL en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Añadir 60 μL de tampón de transfección a la mezcla. Para obtener los mejores resultados, agregue el tampón de transfección gota a gota mientras agita suavemente la mezcla de ADN en el vórtice.
- Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos. Evite agitar el tubo de incubación durante el tiempo de incubación colocando el tubo junto a la campana de flujo laminar.
- Debajo de la campana de flujo laminar, retire el medio de cultivo celular ("medio acondicionado") de los pocillos con una pipeta de 1000 μL y guárdelo en un recipiente separado en la incubadora.
- Añadir 500 μL de medio sérico reducido a cada pocillo. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 hasta que finalice el período de incubación de 20 minutos (paso 2.3.3).
- Añadir 30 μL de mezcla de transfección a cada pocillo pipeteando varias gotas. Deseche el residuo en el fondo del tubo.
- Después de que todos los pocillos hayan sido suministrados con la mezcla de transfección, agite suavemente la placa de 24 pocillos para asegurar la distribución de la mezcla de transfección en el medio.
- Incubar los pocillos durante 60 minutos a 37 °C y 5% de CO2.
- Retire y deseche la mezcla de transfección y lávela tres veces con medio de cultivo celular. Agregue 1 mL de medio de cultivo celular a cada pocillo e incube durante 30 segundos a RT. Retire 750 μL de medio y agregue la misma cantidad de medio fresco. Repita esto tres veces.
NOTA: El paso de lavado es crítico. Mantenga al mínimo el tiempo que cada pocillo no tiene medio (es decir, retírelo y reemplácelo pozo por pozo) y agregue el medio de lavado suavemente.
- Retire y deseche el medio de cultivo celular y agregue 450 μL del medio acondicionado pocillo por pocillo.
- Deje que las neuronas maduren en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 a DIV 10.
>3. Estimulación y captación de Syt1
NOTA: El siguiente protocolo aplica la absorción a 3 pozos. Para la despolarización de cualquier otro número de pozos, ajuste las cantidades en consecuencia.
- Prepare 50 mL de tampón de despolarización 10x (640 mM de NaCl, 700 mM de KCl, 10 mM de cloruro de magnesio, MgCl2, 20 mM de cloruro de calcio, CaCl2, 300 mM de glucosa, 200 mM de HEPES, pH 7,4) en un matraz Erlenmeyer.
NOTA: El tampón de despolarización puede mantenerse a 4 °C durante varias semanas. Si también se utiliza una solución no despolarizante, prepare una solución de Tyrode 10x que consista en 1290 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 20 mM de CaCl2, 300 mM de glucosa, 200 mM de HEPES pH 7,4 para comparar el reciclaje inducido por estimulación con el reciclaje espontáneo. Después de la dilución a 1x, agregue 1 μM de tetrodotoxina antes de usar para bloquear la generación de potencial de acción.
- Disolver 1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0,1 g de MgCl2-6H 2O, 0,15 g de CaCl 2-2H2O y 3,0 g de glucosa-1 H2O y 2,38 g de HEPES en 50 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer. Ajustar el pH con NaOH y filtrar estérilmente la solución. Diluya el tampón 1:10 en agua destilada para lograr una concentración 1x.
- Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (pH 7,4) para la fijación después de la estimulación.
- Para 500 mL de PFA al 4% en 1x PBS, disuelva 20 g de paraformaldehído en 450 mL de H2O. destilado
NOTA: Calentar la solución puede acelerar la disolución, pero no caliente la solución a más de 70 °C, ya que el PFA puede desintegrarse.
cautela: El PFA es tóxico, potencialmente cancerígeno y teratogénico. Use guantes cuando trabaje con PFA, trabaje debajo de la campana extractora y evite la ingestión.
- Deje que la solución se enfríe a RT y agregue 50 mL de solución madre de PBS 10x. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH / HCl (ácido clorhídrico) usando un medidor de pH.
- Precalentar 600 μL de tampón de despolarización 1x y 10 mL de medio de cultivo celular a 37 °C en el baño de agua.
- Añada 1 μL de anticuerpo anti-Syt1 de ratón (clon 604.2) al tampón de despolarización 1x y al vórtice durante 10 segundos.
- Retire y deseche el medio de cultivo celular de las células. Añadir 200 μL de la mezcla de despolarización y anticuerpos a cada pocillo e incubar durante 5 minutos a 37 °C y 5% de CO2 en la incubadora.
- Retire y deseche la mezcla de despolarización y anticuerpos y lávela tres veces con medio de cultivo celular. Agregue 1 mL de medio de cultivo celular a cada pocillo e incube durante 30 segundos a RT. Retire 750 μL de medio y agregue la misma cantidad de medio fresco. Repite tres veces.
- Retire y deseche el medio de cultivo celular y agregue 300 μL de PFA al 4% en 1x PBS. Incubar durante 20 minutos a 4 °C.
- Lavar tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
4. Inmunocitoquímica
- Prepare 50 mL de tampón de bloqueo.
NOTA: El tampón de bloqueo puede mantenerse a -20 °C durante varios meses.
- Disolver 2,5 g de sacarosa y 1 g de albúmina sérica bovina (BSA) en 5 mL de solución madre de PBS 10x. Añadir 1,5 mL de solución de detergente al 10%. Agitar la solución hasta que todos los componentes se hayan disuelto correctamente y añadir el H2O destilado hasta alcanzar un volumen final de 50 mL. Alícuota la solución y congelar las alícuotas para su almacenamiento.
- Diluir el anticuerpo secundario acoplado a fluoróforos (dirigido contra la especie primaria de anticuerpo Syt1) en 200 μL de tampón de bloqueo en cada pocillo a una dilución de 1:1000.
- Retire y deseche el 1x PBS de cada pocillo que contenga un cubreobjetos.
- Añadir 200 μL de mezcla de tampón bloqueante y anticuerpo a cada pocillo e incubar durante 60 minutos a RT.
cautela: Debido a que los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz, todos los pasos hacia adelante deben realizarse en la oscuridad.
- Después de la incubación, lave las células tres veces durante 5 minutos con 1 ml de 1x PBS.
- Incruste los cubreobjetos en los portaobjetos del microscopio con el medio de inclusión.
- Añada una gota de 7 μL de medio de inclusión en el portaobjetos del microscopio. Retire el cubreobjetos de la placa de 24 pocillos levantándola con una jeringa y agarrándola con pinzas.
cautela: Las células de la superficie del cubreobjetos se dañan fácilmente, por lo que las pinzas deben manipularse con cuidado.
- Sumerja el cubreobjetos en agua destilada para eliminar el PBS y séquelo con cuidado tocando un borde con el tejido blando.
- Voltee el cubreobjetos sobre la gota de medio de inclusión, de modo que la superficie que transporta las células quede frente al portaobjetos del microscopio, incrustando así las células en el medio de inclusión.
- Deje secar los portaobjetos bajo la campana durante 1 a 2 h (cúbralos para evitar la exposición a la luz) y guárdelos en una caja de portaobjetos de microscopio a 4 °C.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.