1. Tratamiento de neuronas
>Nota: El tratamiento se ha realizado en la División (DIV) 7. Todos los pasos se llevan a cabo bajo una campana de cultivo celular en condiciones estériles. En la Figura 1 se ilustra un ejemplo de la densidad de cultivo neuronal cortical en DIV 7.
- Agrupar agregados de αS asociados a microsomas obtenidos de la médula espinal de tres ratones transgénicos enfermos diferentes para obtener una solución de 1 μg/μL, utilizando el tampón de homogeneización original [compuesto por 250 mM de sacarosa, 20 mM de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico), 10 mM de KCl (cloruro de potasio), 1,5 mM de MgCl2 ((cloruro de magnesio), 2 mM de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), y 1x inhibidores de fosfatasa/proteasa] para la dilución.
- Tome un cultivo de neuronas en cubreobjetos de poli-D-lisina en placas de 24 pocillos que contengan medio (2% B27, 10x gentamicina y 2 mM de glutamina). Retire 1/3 del medio y reemplácelo suavemente con el medio fresco que contiene 2% de B27, 1x gentamicina y 2 mM de glutamina.
- Agregue 1 μg de agregados de alfa-sinucleína (αS) asociados a microsomas agrupados al medio celular. Regrese las neuronas a la incubadora a 37 °C.
- Cada 3 días durante 1 semana, agregue 1/3 de medio fresco. No reemplace el medio. Solo tienes que añadirlo.
- Después de 1 semana de tratamiento, retire 1/3 del medio y reemplácelo suavemente con el medio fresco que contiene 2% de B27, 10 μg/mL de gentamicina y 2 mM de glutamina. Repetir cada 3 días.
- Fijar las neuronas después de 2 semanas de tratamiento (DIV 21).
2. Inmunofluorescencia
- Fije las neuronas con paraformaldehído al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y sacarosa al 5% durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) sin agitar bajo una campana de humos químicos.
- Retire la solución de fijación. Lavar brevemente con PBS 1 vez, 3 veces.
nota: Realice todos los pasos de lavado con suavidad porque las neuronas primarias no se adhieren firmemente a los cubreobjetos de polilisina.
- Permeabilice las neuronas con un 0,3% de tensioactivo no iónico en PBS 1x durante 5 min en RT.
- Lavar brevemente con PBS 1 vez, 3 veces.
- Incubar neuronas con un 3% de suero fetal bovino (FBS) en PBS 1x durante 30 minutos en RT para bloquear sitios de unión inespecíficos en un agitador orbital.
- Incubar neuronas con anticuerpo primario apropiado disuelto en FBS al 3% en PBS 1x, O/N a 4 °C en un agitador orbital.
NOTA: se utilizaron anticuerpos syn303 (1:1.000), αS (1:200), pser129-αS (1:1.000) y Tau (1:10.000).
- Retire la solución de anticuerpos y lávese, brevemente, con PBS 1x, 3 veces.
- Incubar neuronas con anticuerpo secundario fluorescente apropiado disuelto en FBS al 3% en PBS durante 1 h en RT en la oscuridad en un agitador orbital.
- Retire la solución de anticuerpos y lávese, brevemente, con PBS 1x, 3 veces.
- Teñir las neuronas con la solución de DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) (0,1 μg/mL en PBS 1x) durante 15 min en RT en la oscuridad en un agitador orbital.
- Retire la solución de anticuerpos y lávese, brevemente, con PBS 1x, 3 veces.
- Monte los cubreobjetos en una corredera utilizando un medio de montaje antidecoloración.
