Un modelo in vitro de lesión por estiramiento en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas

Resumen

Fuente: Phillips, J. K. et al. Método para la lesión por estiramiento a alta velocidad de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas en un formato de 96 pocillos. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el proceso de inducción de lesiones por estiramiento en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCNs). Las células se toman en una placa multipocillos sin fondo con una membrana de silicona adjunta. Se aplica un estrés mecánico controlado en la membrana para inducir la disrupción del citoesqueleto y el daño de la membrana celular, induciendo un fenotipo de lesión por estiramiento en las células.

Protocolo

1. Fabricación de placas

1. Trate con plasma la parte superior de una placa de 96 pocillos con un limpiador de plasma de 200 W (consulte la Tabla de materiales) durante 60 s a alta potencia, colocándola con la parte inferior hacia arriba dentro del limpiador de plasma. Compruebe si hay un brillo púrpura visible a través de la ventana de la cámara, lo que indica que se ha formado un plasma efectivo. Esta técnica de unión es una adaptación de Sunkara et al.
2. Dentro de los 60 s, coloque la parte superior de la placa en 200 mL de trietoxisilano al 1,5% (3-aminopropil) (APTES) en agua desionizada (DI) durante 20 min, con la parte inferior hacia abajo. Esta solución es inestable: prepárelo no más de 60 s antes de introducir la placa.
   cautela: Trabaje con APTES en una campana extractora.
3. El plasma trata una membrana de silicona extraída en el limpiador de plasma durante 60 s a alta potencia. Programe el tratamiento con plasma de manera que no termine más de 5 minutos antes del final del período de 20 minutos en el paso 1.2.
4. Utilice pinzas para colocar la membrana tratada con plasma sobre un rectángulo de papel pergamino de 7,5 x 11 cm². Alinee una losa de aluminio de 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm en la parte inferior de la abrazadera de fabricación de placas. Alinee la membrana de silicona y el papel pergamino sobre la losa de aluminio con pinzas.
5. Retire la parte superior de los platos del baño APTES y sacuda el exceso de solución. Sumérjase en un baño de agua desionizado de 200 ml durante 5 s y sacuda el exceso de agua. Sumérjase en un baño de agua desionizado de 200 ml durante 5 segundos y sacuda el exceso de agua. Reemplace el agua en estos baños antes de sumergir otra placa en la parte superior.
6. Utilice aire comprimido para secar completamente la parte superior de la placa.
7. Coloque la parte superior de la placa en la parte superior de la abrazadera de fabricación de placas. Cierre suavemente la abrazadera de fabricación de placas para presionar la parte superior de la placa y la silicona. Abrazadera durante al menos 1 h.
8. Deje que la placa se cure durante 24 horas a temperatura ambiente antes de usarla, protegida del polvo.

>2. Estirar un plato

1. Limpie las indentaciones
   1. Prepare un sonicador de 60 W tipo baño con agua desionizada a temperatura ambiente.
   2. Apoye el bloque de indentadores por encima del baño del sonicador, invertido de modo que solo las partes superiores de los indentadores queden sumergidas a una profundidad de al menos 1 mm. Sonicar los indentadores durante 8 min a 42 kHz.
   3. Seque los indentadores con aire comprimido.
2. Alinear el bloque indentador
   1. Coloque una cámara con una transmisión en vivo sobre el dispositivo de estiramiento de modo que mire hacia abajo en la matriz de indentadores. Concéntrese en la parte superior de los indentadores.
      nota: La configuración descrita en la Sección 3, "Caracterización del estiramiento de la membrana", es una posible configuración de cámara para esta tarea.
   2. Asegure una placa en la platina del dispositivo de lesión utilizando las abrazaderas de la platina (Figura 1) y coloque una luz de techo sobre el dispositivo.
      nota: Consulte la Tabla de materiales para el software de control de instrumentos.
   3. Inicie el software de control de instrumentos haciendo clic en el icono del software en el escritorio de la computadora que está controlando el dispositivo de lesiones. Ejecute el proyecto "in_vitro_neurotrauma.lvproj" haciendo clic en él en la ventana de inicio. Desde la ventana del proyecto, inicie los instrumentos virtuales (VI) de control de movimiento y seguimiento de posición, que se denominan 'motion_control.vi' y 'position_tracker.vi', respectivamente, haciendo doble clic en ellos.
   4. Cierre la jaula que rodea el dispositivo de lesión. Presione el botón de 'flecha' en la esquina superior izquierda del VI de control de movimiento para ejecutar el VI y haga clic en 'Cerca de la parte inferior' para bajar la etapa a menos de 2 mm de entrar en contacto con los indentadores. Haga clic en el botón 'Stop' para detener el VI.
      cautela: Mantenga las manos alejadas de la camilla cuando manipule la cámara en la jaula. La jaula debe estar equipada con un interruptor de puerta que suministre energía al dispositivo de estiramiento solo cuando la puerta de la jaula esté cerrada.
   5. En la ventana del proyecto, haga clic con el botón derecho en 'Eje 1'. Haga clic en 'Panel de prueba interactivo'. En la ventana que se abre, establezca el tamaño del paso en 50 μm introduciendo '500' unidades en el campo 'Posición objetivo'.
   6. Haga clic en el botón verde 'ir' en la parte inferior de la ventana 'Panel de prueba interactivo' repetidamente hasta que la placa haga contacto por primera vez con cualquier indentador. Compruebe si hay contacto en la imagen en vivo mostrada por la cámara. Observe la posición vertical de la platina que se informa en la parte superior izquierda de la ventana 'Panel de prueba interactivo'; Esta es la primera posición de contacto.
   7. Baje aún más (como se describe en el paso 2.2.6) hasta que todos los pocillos hayan hecho contacto con los indentadores. Si es necesario, mueva la cámara para ver toda la placa y mueva el escenario hacia arriba (especificando una 'Posición objetivo' negativa) y hacia abajo. Observe la posición vertical del escenario que se informa en la parte superior izquierda de la ventana cuando todos los puestos están en contacto (esta es la posición de contacto completo).
   8. Nótese la diferencia entre las posiciones de primer contacto y de contacto completo. Cierre el 'Panel de prueba interactivo'. Ejecute el 'control de movimiento VI' (consulte el paso 2.2.4) y haga clic en 'Superior' para subir el escenario. Detenga el control de movimiento VI con el botón 'Stop'.
   9. Una vez que la etapa esté en la parte superior de su recorrido, abra la puerta para desactivar el dispositivo. Ajuste los tornillos de fijación en las esquinas del bloque indentador. Afloje el tornillo de fijación en la esquina que hizo contacto primero, para bajarlo y apriete el tornillo opuesto para levantar la esquina que hizo el contacto al final.
   10. Repita el proceso de bajar la etapa hasta que la placa entre en contacto con los indentadores, inspeccionando las imágenes de contacto para ver si están inclinadas, elevando la etapa y ajustando (paso 2.2.9) el bloque del indentador. Cuando la platina y el bloque están alineados, todos los indentadores harán contacto a la vez.
   11. Abra la puerta para desactivar el dispositivo. Inserte los tornillos de amarre en sus orificios en el bloque dentador y apriételos. Confirme que el bloque esté nivelado con los tornillos de amarre en su lugar (pasos 2.2.4-2.2.8). Tome nota de la posición de la platina informada por el 'Panel de prueba interactivo' cuando la placa hace contacto. Esta será la posición cero para los experimentos de sangría.
3. Lubricar los indentadores
   1. Si el bloque dentador se acaba de instalar y aún no se ha lubricado, limpie una almohadilla de goma sólida (7,5 cm x 11 cm x 1,5 mm) y una almohadilla de goma espuma suave de celda cerrada (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) con una toallita de laboratorio empapada en etanol. Deja que se sequen al aire.
   2. Remoja una toallita de laboratorio en aceite de maíz y extiéndela sobre la almohadilla de goma sólida hasta obtener un brillo opaco.
   3. Coloque la almohadilla de espuma sobre la almohadilla de goma sólida para transferir el aceite a la almohadilla de espuma. Coloque una losa de aluminio de 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm encima de la almohadilla de espuma y cárguela con un peso de lastre de aproximadamente 360 g (por ejemplo, 6 tubos cónicos cargados con 45 ml de agua cada uno) para garantizar una transferencia constante de aceite de la almohadilla de goma sólida a la almohadilla de espuma. Espere 10 s para que el aceite se transfiera a la almohadilla de gomaespuma.
   4. Mueva la almohadilla de goma espuma sobre la matriz del indentador. Coloque la losa de aluminio y el peso del lastre encima para asegurar una transferencia constante del aceite a las puntas de los indentadores. Espere 10 s para que el aceite se transfiera a los indentadores.
   5. Si no se ha estirado ninguna placa desde que el bloque indentador se configuró y lubricó por primera vez, estire una placa de prueba antes de comenzar el experimento. Nota: Esto evitará que cualquier inconsistencia entre el primer tramo y los tramos posteriores confunda el experimento. Para estiramientos posteriores, repita solo los pasos 2.3.2-2.3.5 antes de cada estiramiento.
4. Estirar un plato
   1. Lubrique los indentadores como se describe en el paso 2.3.
   2. Asegure la placa en la etapa del dispositivo de lesión con las abrazaderas de etapa. Si se requiere esterilidad, ajuste la posición de la tapa para asegurar la placa sin exponer la superficie de cultivo al aire ambiente.
   3. Baje la platina a la posición cero utilizando el 'control de movimiento VI' (véanse los pasos 2.2.4-2.2.6); la posición cero se determina durante el paso 2.2.
   4. Cambie el nombre del archivo en el campo "ruta del archivo" en el "VI de seguimiento de posición" por un nombre de archivo único, luego ejecútelo con el botón de "flecha" en la esquina superior izquierda de esa ventana.
   5. Establezca la profundidad y la duración de la indentación (normalmente 1-4 mm y 30 ms, respectivamente, profundidad máxima 5 mm, duración mínima 15 ms) en los campos 'Lesión (mm)' y 'Duración de la lesión (ms)' en el 'panel de control de movimiento VI' haciendo clic en los campos y escribiendo los valores deseados.
   6. Ejecute el 'panel de control de movimiento VI' y haga clic en 'Lesionar' para sangrar la placa.
   7. Mueve el escenario hasta la parte superior de su recorrido haciendo clic en 'Arriba'. A continuación, detenga el VI con el botón 'Stop' y desactive el dispositivo de lesiones abriendo la puerta.
   8. Inspeccione el historial de desplazamiento de la etapa presentado en el 'rastreador de posición VI' para confirmar que se aplicó el desplazamiento máximo especificado. Haga clic derecho en el gráfico y haga clic en 'exportar a Excel'. Haga clic en 'Archivo| Guardar' para guardar los datos.

>3. Caracterización del estiramiento de la membrana

1. Pinte el hueco en la parte superior de cada penetrador de blanco para proporcionar un fondo de alto contraste para la videografía de alta velocidad. Precaución: No pinte los bordes de los indentadores donde entren en contacto con las placas.
2. Imprima en 3D con poli(ácido láctico) (PLA), o de otro modo fabrique, un sello cilíndrico con el que hacer un punto en cada pozo. Hacer el cilindro de 5,9 mm de diámetro y 12,2 mm de alto, con una protuberancia cilíndrica de 1,5 mm de diámetro y 1,0 mm de altura centrada en la parte superior.
3. El plasma trata la placa con el lado derecho hacia arriba para activar la superficie de cultivo celular de silicona en los pocillos durante 60 s, como se mencionó en el paso 2.1.
4. Coloque la placa sobre una almohadilla de goma u otra superficie blanda. Imprime la pequeña protuberancia del sello (ver paso 1.2) con tinta de un rotulador permanente. Inserte el sello en el pocillo que se va a probar y golpee para asegurar una buena transferencia de tinta. Prepara el sello antes de cada pocillo.
5. Alinee el bloque dentador y lubrique los indentadores del dispositivo de lesión (consulte los pasos 2.2-2.3). Sujete la placa en la platina del dispositivo de lesión. Coloque una luz axial difusa brillante sobre el dispositivo de lesión.
6. Coloque una cámara de alta velocidad en un soporte de brazo sobre el dispositivo de lesión, mirando hacia abajo, con la lente configurada en el número f más pequeño, y enciéndala. Inicie el software de la cámara en el ordenador conectado a la cámara. En el menú desplegable de velocidad de fotogramas, seleccione 2.000 fotogramas por segundo, y en el menú desplegable del obturador, seleccione el tiempo de exposición más rápido que produzca imágenes de alto contraste. Céntrate sobre los pozos punteados.
   1. Coloque la cámara de modo que el campo de visión contenga 12 pocillos en una cuadrícula de 3 x 4.
      nota: Este campo de visión ofrece un compromiso óptimo entre rendimiento y resolución para una imagen de 1.280 × 1.024.
7. Baje la placa hasta el punto cero (consulte los pasos 2.2.4-2.2.6). Haga un clic en el botón de grabación en el software de la cámara para que se lea 'trigger in'. Inicie el rastreador de posición VI (paso 2.4.4).
8. Encienda la luz axial difusa brillante. Ancle sangría a la placa como se describe en el paso 2.4.6.
9. Apague la luz axial difusa brillante.
10. En la computadora de control de la cámara, busque la ventana de 30-40 ms de la grabación en la que se produce la sangría: arrastre las flechas de inicio y fin en la barra de reproducción de video de alta velocidad en el software de la cámara. Haga clic en Guardar, establezca el nombre en el campo 'Nombre de archivo', seleccione 'TIFF' en el campo 'Formato' y haga clic en 'Guardar'.
    1. Mire a través de la extensión . Archivos TIF para imágenes de los estados menos estirados (inicio) y más estirados (sangría de picos).
    2. Para medir la altura y la anchura de los puntos de ambas imágenes, utilice Fiyi para abrir las imágenes del tramo mínimo y máximo una al lado de la otra. Con la herramienta de selección rectangular predeterminada, haga clic y arrastre para dibujar un cuadro alrededor de un punto en la imagen menos estirada. Mida la altura y el ancho con 'Analizar| Medir'.
    3. Repita para el punto en el mismo pozo en la imagen de estiramiento máximo. Repita para el resto de los pozos.
11. Calcule la deformación lagrangiana en las direcciones x e y de la siguiente manera:
    
    nota: Aquí, E_xx es la deformación lagrangiana en la dirección x, E_yy es la deformación lagrangiana en la dirección y, X es el ancho del punto, Y es la altura del punto, _f denota la imagen final (es decir, la imagen de sangría máxima) e _i denota la imagen inicial (es decir, la imagen previa a la sangría). Promedie los dos valores para determinar la deformación en ese pozo.

>4. Siembra de las células cultivadas

1. Esterilizar en autoclave los contenedores y los pesos de lastre que se utilizarán para la esterilización.
2. Trate con plasma las placas con fondo de silicona con el lado derecho hacia arriba durante 60 s (ver paso 1.1). Sumerja inmediatamente las placas en recipientes estériles que contengan etanol al 70% durante 15 min.
3. Sumerja las placas en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en recipientes estériles separados durante 30 minutos.
4. Aspire el PBS de los pozos. Seque solo una placa a la vez para evitar que los pocillos pierdan el tratamiento con plasma.
   cautela: Las placas con fondo de silicona proporcionan menos retroalimentación táctil que las placas rígidas al pipetear y es más probable que bloqueen la punta de una pipeta.
5. Añadir 100 μL de 0,1 mg/mL de poli-L-ornitina (PLO) por pocillo a las placas esterilizadas. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
6. Enjuague los pocillos dos veces con 100 μL de PBS estéril, dejando el segundo lavado en los pocillos hasta que la suspensión celular esté lista.
7. Retire el vial de hiPSCN del almacenamiento de nitrógeno líquido con guantes de seguridad y colóquelo sobre hielo seco. Transporte rápidamente el vial a un baño de agua a 37 °C y descongele durante exactamente 3 minutos. No agite el vial.
8. En una campana estéril, transfiera suavemente el contenido del vial a un tubo cónico de 50 mL con una pipeta serológica de 1 mL.
9. Enjuague el vial criogénico vacío con 1 mL de medio de mantenimiento completo a temperatura ambiente (base de medios + suplemento).
10. Transfiera 1 mL de medio al tubo de 50 mL gota a gota a aproximadamente una gota por segundo. Agite suavemente el tubo mientras lo agrega. Agregue 8 mL de medio de mantenimiento completo a temperatura ambiente al tubo de 50 mL a aproximadamente 2 gotas/s.
11. Tape el tubo e inviértalo 2-3 veces. Cuente las células con un hemocitómetro. Calcule el volumen de los medios adicionales necesarios para diluir la suspensión celular a 225.000 células/mL.
12. Pipetear suavemente la cantidad de medio (calculada anteriormente) en el tubo de suspensión celular con una pipeta serológica de 25 mL.
13. Añada 10 μL de 1 mg/mL de material de laminina por 1 mL de suspensión celular con una micropipeta de 1.000 μL para lograr 10 μg/mL de laminina en la suspensión celular. Aspire hacia arriba y hacia abajo una vez con la punta utilizada para la laminina, luego tape el tubo e invierta el tubo una vez.
14. Aspire el PBS de las placas, una placa a la vez. Utilice una pipeta multicanal para añadir 100 μL de suspensión de células hiPSCN a cada pocillo. Los pocillos tienen un área de cultivo de 0,33^cm2, por lo que la densidad celular por área es de 67.500 células/^cm2.
15. Deje reposar las placas a temperatura ambiente durante 15 minutos después de la siembra para promover la adhesión. Para evitar las vibraciones del ventilador de la campana de cultivo estéril, coloque las placas cubiertas en la mesa del laboratorio. Incubar los cultivos a 37 °C con 5% de CO₂.
16. Realice un cambio completo de medios a las 24 h, rellenando los pocillos con 200 μL de medios de mantenimiento completos. Realice un cambio de medio de 100 μL/pocillo cada 2-3 días.

>5. Hiriendo culturas

1. Alinee el bloque dentador y encuentre la posición cero como se describe en el paso 2.2. Lubrique los indentadores como se describe en el paso 2.3.
2. Establezca el nombre del archivo para el historial de desplazamiento en el 'rastreador de posición VI' (paso 2.4.4). Ajuste los parámetros de lesión en el 'control de movimiento VI' (paso 2.4.5).
3. Saque la placa que se va a lesionar de la incubadora y sujétela a la plataforma. Ajuste la posición de la tapa para asegurar la placa sin exponer los cultivos al aire de la habitación.
4. Baje la placa hasta el punto cero (pasos 2.2.4-2.2.6) utilizando el 'control de movimiento VI'. Inicie el 'rastreador de posición VI' (paso 2.4.4).
5. Utilice el control de movimiento VI para indentar la placa (como se describe en el paso 2.4.6). Para estiramientos simulados, omita solo este paso.
6. Vuelva a colocar el escenario en la parte superior de su rango de movimiento (consulte el paso 2.4.7). Regrese la placa a la incubadora.
7. Inspeccione y guarde la traza de desplazamiento (como en el paso 2.4.8).

Resultados

Figura 1: Un esquema etiquetado del dispositivo de lesiones.(A) Vista superior, (B) vista isométrica, (C) vista frontal, (D) vista lateral derecha. La barra de escala se aplica a las vistas ortogonales (A, B y D).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lámina de silicona de .010"	Fabricación Especializada, Inc	#70P001200010	Lámina de polidimetilsiloxano (PDMS)
Sparkleen	Fisher Científico	#043204
Nunc 256665	Fisher Científico	#12-565-600	Placa de 96 pocillos sin fondo
Toallitas Kim	ULINO	S-8115
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	#PDC-001-HC
(3-aminopropilo) trietoxisilano	Sigma-Aldrich	#440140	APTES
Papel pergamino	Reynolds	N/A
Luz de cúpula	CCS inc	LFX2-100SW
Fuente de alimentación de luz de cúpula	CCS inc	PSB-1024VB
Unidad de iluminación difusa axial	siemens	Nerlite DOAL-75-LED	Luz axial difusa
Matriz de LED de alta potencia	cree	XLamp CXA2540	Matriz de LED de alta potencia
Soporte LED	Molex	1807200001	Soporte LED
Fuente de alimentación LED	Bien intencionado	HLG-320H-36B	Fuente de alimentación de corriente constante
Software FastCam Viewer	Fotron		Softeware de la cámara
Fastcam Mini UX50	Fotron	N/A	Cámara de alta velocidad
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8	Nikon	#1455	Lente de cámara de alta velocidad
0,1 mg/mL de poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich	#P4597
iCells (Células i)	Dinámica Celular Internacional	#NRC-100-010-001
Medios iCell	Dinámica Celular Internacional	#NRM-100-121-001
Suplemento iCell	Dinámica Celular Internacional	#NRM-100-031-001
Laminina	Sigma-Aldrich	#L2020
bobina	BEI Kimco	LA43-67-000A
codificador lineal óptico	Renishaw	T1031-30A
Servoaccionamiento	Controles Copley	Xenus XTL
controlador	Instrumentos Nacionales	Controlador PowerPC en tiempo real cRIO 9024
Chasis cRIO	Instrumentos Nacionales	cRIO 9113
Módulo de entrada digital	Instrumentos Nacionales	NI 9411
Chasis de adquisición de datos	Instrumentos Nacionales	NI 9113
LabVIEW	Instrumentos Nacionales
hiPSCNs	Dinámica Celular Internacional

actuador de móvil