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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Animales
- Mantener la cepa de pez cebra TgBAC (gfap:gfap-GFP) envejecida entre 6 y 9 meses en condiciones estándar en agua con una temperatura de 26,5 °C y un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h.
>2. Anestesia sistémica reversible
- Prepare la solución madre de sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (tricaína) disolviendo 400 mg de polvo de tricaína en 97,9 mL de agua del tanque y 2,1 mL de 1 M de solución salina tamponada (TBS) Tris. Ajuste a pH 7.0 con 1 M Tris (pH 9) y almacene a 4 °C en la oscuridad hasta un mes.
nota: La tricaína debe prepararse en agua como las condiciones de vida naturales del animal, preferiblemente se debe utilizar agua original del tanque.
- Diluya la solución madre a 1:25 en el agua del tanque y úsela inmediatamente.
- Coloque el pez cebra en una placa de Petri de 10 cm que contenga 50 mL de solución anestésica hasta que quede inmóvil y no responda a los estímulos externos (aproximadamente 2 a 5 min, dependiendo del peso y la edad).
- Transfiera cada pez a mano a un soporte de alfiler de silicona hecho a medida para el tratamiento con láser (Figura 1A).
¡cautela! Los peces pueden permanecer anestesiados fuera del tanque hasta por 10 minutos solamente.
- Para revertir la anestesia después del tratamiento y/o la toma de imágenes, coloque el pez cebra en un recipiente que contenga agua del tanque.
- Para apoyar la recuperación, cree un flujo de agua dulce del tanque sobre las branquias moviendo el pez cebra hacia adelante y hacia atrás en el agua.
>3. Lesión focal con láser en la retina
>NOTA: Se utiliza un láser de diodo de 532 nm para crear daño de luz focal en la retina del pez cebra. La configuración experimental del láser permite el establecimiento de una lesión focal de la retina reproducible en el pez cebra adulto.
- Configure la potencia de salida del láser: 70 mW; diámetro de la antena: 50 μm; duración del pulso: 100 ms.
¡cautela! El uso de la luz láser requiere una protección personal adecuada y el etiquetado de la zona.
- Aplique 1 - 2 gotas de hidroxipropilmetilcelulosa al 2% por vía tópica en el ojo antes del tratamiento y use una lente láser de fondo de ojo de 2.0 mm para enfocar el haz de puntería láser en la retina.
¡cautela! Las gotas de hidroxipropilmetilcelulosa son viscosas y pueden causar problemas para respirar si entran en las branquias.
- Coloque cuatro puntos láser alrededor del nervio óptico en el ojo izquierdo y use el ojo derecho, sin tratar, como control interno.
