Medición de la activación del receptor odorante mediante un ensayo de monofosfato de adenosina cíclico en tiempo real

Resumen

Fuente: Zhang, Y. et al., Medición en células vivas de la activación del receptor de odorantes utilizando un ensayo de AMPc en tiempo real. J. Vis. Exp.(2017)

Este video muestra el protocolo para medir la activación del receptor odorante en células transfectadas utilizando un biosensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) y detección de luminiscencia. El método se aplica para estudiar las interacciones receptor-ligando y las vías de señalización en las neuronas olfativas.

Protocolo

>1. Estimulación y medición de la actividad del receptor odorante (OR) mediante el ensayo cAMP en tiempo real

1. Observe las células transfectadas bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia adecuada del 50-80% por pocillo y regrese a la incubadora.
2. Prepare el medio de estimulación añadiendo 10 mM de ácido hidroxietilpiperazinaetanosulfónico (HEPES) y 5 mM de glucosa a la solución salina equilibrada de Hank (HBSS).
3. Descongele las alícuotas del reactivo del sustrato del ensayo cAMP en tiempo real en hielo. Almacene el reactivo de sustrato a -80 °C a 55 μL por tubo en tubos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Utilice 1 tubo por plato.
4. Prepare la solución de equilibrio al 2% mezclando 55 μL del reactivo de sustrato y 2750 μL de solución de HBSS/HEPES/glucosa.
5. Extienda una capa gruesa de toallas de papel en el banco. Golpee suave y repetidamente el plato boca abajo sobre la toalla de papel para que el medio de transfección sea completamente absorbido por él.
6. Lave las células pipeteando 50 μL de solución de HBSS/HEPES/glucosa en cada pocillo.
7. Extraiga suave y repetidamente la solución de HBSS/HEPES/glucosa de la placa de 96 pocillos.
8. Pipetear 25 μL de solución de equilibrio al 2% en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2 h.
9. Prepare con anticipación soluciones madre odorantes 1 M en dimetilsulfóxido (DMSO) y almacene a -20 °C hasta su uso.
10. Antes del final del tiempo de incubación, diluya las soluciones madre odorantes a concentraciones de trabajo en el medio de estimulación HBSS/HEPES/glucosa.
    nota: Las concentraciones de las diluciones odoríferas preparadas en este paso deben duplicarse para producir las concentraciones finales correctas en cada pocillo.
11. Usando un lector de placas de quimioluminiscencia y antes de la adición de odorante, mida el nivel de luminiscencia basal de la placa durante 2 veces consecutivas a una velocidad de 1000 ms por pocillo.
12. Retire rápidamente la placa del lector de placas, agregue diluciones de odorante de 25 μL a cada pocillo e inicie inmediatamente la medición continua de la luminiscencia de todos los pocillos durante 20 ciclos dentro de 30 min.
    nota: Pipetea con cuidado para evitar contaminar los pozos vecinos cuando utilices diferentes odorantes y/o diferentes concentraciones de los mismos odorantes en la misma placa.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dmso	sigma	D2650
Reactivo GloSensor cAMP	Promega	E1290
HBSS, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Muscono	Santa Cruz	SC-200528
Almizcle tibetene	Sigma-Aldrich	S359165
PBS, sin calcio o magnesio	Cellgro	21-040-CV
Tubo de PCR de 0,2 ml	Axygen	PCR-02-C
Tubo Eppendorf de 1,5 ml	Eppendorf
Tubo cónico de 15 mL de 17 mm x 120 mm	Halcón BD	352096
Pipeta multicanal de 8 pocillos y/o 12 pocillos	Eppendorf
Placa de cultivo de glóbulos blancos de fondo plano de 96 pocillos	Greiner	655098
Placa de cultivo celular de 100 mm x 20 mm	Halcón BD	353003
Lector de placas infinito F200	Tecan