Caracterización del espacio extracelular en un corte de cerebro utilizando microelectrodos selectivos de iones e iontoforesis

Abstract

Fuente: Odackal, J., et al. Iontoforesis en tiempo real con tetrametilamonio para cuantificar la fracción de volumen y la tortuosidad del espacio extracelular cerebral. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra cómo caracterizar el espacio extracelular en un corte de cerebro mediante el uso de microelectrodos selectivos de iones e iontoforesis para medir y comparar señales eléctricas. Este proceso ayuda a determinar el volumen, la fracción y el grado de torsión del espacio.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

>1. Iontoforesis en tiempo real en cortes de cerebro

1. Coloque un corte de cerebro de 400 μm de grosor en la cámara de registro, asegurándose de que esté completamente sumergido en el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que fluye. Coloque la rebanada con un pincel de acuarela y asegúrela suavemente con una rejilla.
2. Mueva el microelectrodo de iontoforesis y el ISM por encima del campo de interés en el corte del cerebro. Sumerja ambos en el ACSF que fluye pero por encima de la rebanada.
3. Compense el voltaje para los canales de referencia y de detección de iones a "0" mV. Espere a que el voltaje en ambos canales se estabilice. En el registrador de gráficos, marque el voltaje medido en el canal de detección de iones del ISM. Utilícelo para calcular el parámetro V de referencia en Wanda.
4. Coloque el microelectrodo ISM y el microelectrodo de iontoforesis a 200 μm de profundidad en el corte y a 120 μm de distancia entre sí. Espere la estabilización de la señal después de mover el microelectrodo en la rebanada de cerebro.
   nota: La corriente de polarización aplicada al microelectrodo de iontoforesis provoca una pequeña acumulación de tetrametilamonio (TMA). Es un error común tomar una grabación demasiado pronto y subestimar la acumulación de señal.
5. En la grabadora de gráficos, marque el voltaje estabilizado medido en el corte del cerebro en el canal de detección de iones del ISM. Calcule la diferencia de voltaje entre la señal TMA medida en los pasos 8.3 y 8.4 e ingrese este valor en el campo "Baseline V (mV)" en el cuadro Measurement Electrode of the Wanda GUI.
6. En el lado izquierdo de la GUI, asegúrese de que todos los parámetros experimentales estén registrados/ingresados correctamente. Establezca "Medio" en "Cerebro", "Número de transporte" en el valor promedio calculado para el microelectrodo de iontoforesis en el paso 7.4 y "Temperatura" en la temperatura del baño que contiene la rebanada.
   NOTA: Se debe registrar V para cada conjunto de mediciones. Wanda convertirá la V basal en el parámetro C (mM) basal (es decir, la concentración de TMA en el tejido cerebral).
7. Inicie la grabación haciendo clic en "Adquirir" y permita que tome una grabación completa. Espere hasta que la señal TMA vuelva a la línea de base antes de adquirir una nueva grabación.
8. Tome dos o tres registros sucesivos antes de retirar los microelectrodos de la ubicación cerebral elegida. Introduzca la temperatura medida en el software Wanda inmediatamente antes de cada grabación.
9. Mueva ambos microelectrodos en diagonal hacia la superficie de la rebanada. Eleve ambos al menos a 50 μm por encima de la rebanada. Usando el registrador de gráficos, determine cualquier cambio entre la V medida ahora y su medición del paso 8.3.
10. Centre las puntas del ISM y los microelectrodos iontoforéticos entre sí en los ejes x, y y z. Obtenga los cambios de espaciado, si los hay, en la pantalla de la caja de control del micromanipulador.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplificador para ISM	Dagan	Modelo IX2-700 Preamplificador intracelular dual	Amplificador de iones y voltaje de referencia con etapas de cabecera N = 0.1 (para barril de referencia) y N = 0.001 (para barril de iones)
Miscroscopio de compuestos biológicos (con objetivo 4x y 10x)			para el astillado de las puntas de los microelectrodos y la inspección de microelectrodos; varios proveedores, p. ej. AmScope
Tubo de vidrio capilar Theta de borosilicato	Aparato de Harvard	Warner Instruments modelo TG200-4; pedido #64-0811	tubo de vidrio de doble barril para microelectrodos selectivos de iones y microelectrodos iontoforéticos; diámetro exterior 2,0 mm, diámetro interior 1,4 mm, tabique 0,2 mm, longitud 10 cm
Registrador de gráficos			para registrar continuamente los voltajes en el microelectrodo selectivo de iones durante la calibración en patrones de tetrametilamonio y durante el experimento RTI; p. ej., gráfico de doble canal BD112 de Kipp & Zonen registrado, disponible reacondicionado
Software Comercial	El programa MathWorks	MATLAB, caja de herramientas de adquisición de datos	para la adquisición y análisis de datos utilizando los programas Wanda y Walter. Tenga en cuenta que hay una licencia académica disponible.
Gafas de protección ocular	pescador
microscopio compuesto de platina fija	Olimpo	BX51WI	Puede utilizar otros microscopios compuestos con platinas fijas
fórceps	Herramientas de Bellas Ciencias	#11251-10	para astillar el vidrio capilar; Dumond #5, preferiblemente usado y que ya no es necesario para trabajos finos
unidad iontoforética	Dagan	ION-100 y PS-100	ION-100 es una unidad de iontoforesis de un solo canal con cumplimiento de +/- 130 V; PS-100 es una fuente de alimentación externa; alternativas: por ejemplo, Axoprobe-1A fabricado por Axon Instruments (ahora Molecular Devices), fuera de producción, compruebe la disponibilidad de unidades reacondicionadas (eBay y otros sitios)
Soporte de microelectrodos	WPI (en inglés	M3301EH	para sostener el prefabricado de microeletrodo selectivo de iones para la silanización y llenar la punta del barril selectivo de iones con intercambiador de iones líquidos; WPI vende dos versiones de este soporte, M3301EH transparente y M3301EH negro. En nuestra experiencia, el M3301EH transparente parece ser más resistente que el M3301EH negro.
Micromanipulador	Narishige	MM-3	para colocar el microelectrodo selectivo de iones prefabricado durante la silanización y el llenado de la punta del barril selectivo de iones con un intercambiador de iones líquidos; se puede sustituir con cualquier micromanipulador de tres ejes en buenas condiciones de funcionamiento
Objetivo 5x seco	Olimpo	MPlan N
Objetivo 10x Inmersión en agua	Olimpo	UMPlan FL N	El objetivo 10x es la inmersión en agua, la apertura numérica es de 0,3, la distancia de trabajo es de 3,3 mm
Plataforma y platina de traslación X-Y para microscopio de platina fija	EXFO	Gibraltar Burleigh	La plataforma sostiene la cámara de corte, los micromanipuladores y los accesorios, la platina de traslación X-Y mueve el microscopio sin comprometer la estabilidad de la grabación
Micromanipulador robótico con posicionamiento preciso X, Y, Z	Instrumentos Sutter	MP-285	Se necesitan dos micromanipuladores para sujetar por separado el microelectrodo selectivo de iones y el microelectrodo iontoforético. También es posible pegar micropipetas en una matriz espaciada (ver texto).
unidad de acondicionamiento de señal con filtro de paso bajo	Instrumentos Axon	CyberAmp 320 o 380	ya no está disponible en el fabricante, pero puede estar disponible en E-Bay; alternativas: por ejemplo, el filtro/amplificador FLA-01 de Cygnus Technology. Se trata de un instrumento de un solo canal con un corte mínimo de 10 Hz que utiliza un filtro Bessel multipolar, pero la empresa puede estar dispuesta a modificarlo para una frecuencia de corte más baja (2 Hz) si es necesario.
Alambre de plata	Sistemas A-M	#7830	diámetro 0.015", desnudo (sin recubrimiento)
Cámara de corte	Aparato de Harvard	Modelo Warner RC-27L	Esta es la cámara de corte por inmersión; no utilice la cámara de corte de interfaz
Microscopio estereoscópico			para la silanización y el llenado de la punta del barril selectivo de iones con intercambiador de iones líquidos; montado horizontalmente; varios proveedores
cloruro de tetrametimonio (TMA)	Sigma-Aldrich	T-3411	Solución 5 M; ATENCIÓN: toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación), carcinogenicidad, peligroso para el medio ambiente acuático, consulte la información de seguridad de Sigma-Aldrich para obtener una descripción completa