Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Procedimiento quirúrgico
Nota: 20 ratas macho de Sprague-Dawley fueron microinyectadas con proteína beta amiloide compuesta (Aβ) en el ventrículo lateral y el núcleo talámico anterodorsal y designadas como el grupo tratado con Aβ compuesto. Otras 20 ratas fueron sometidas a la misma operación, pero recibieron microinyección de solución salina de dimetilsulfóxido (DMSO) al 0,1% y fueron designadas como el grupo operado simuladamente.
- Anestesiar a las ratas con isoflurano al 100% por inhalación, luego sujetarlas en un aparato estereotáxico cerebral.
- Afeitar el pelaje del vértice de la cabeza con unas tijeras quirúrgicas y desinfectar con yodóforo. Luego, cubra la cabeza con una toalla quirúrgica desechable.
- Hacer una incisión en la piel de la cabeza a lo largo de la pantorrilla longitudinal media con bisturíes quirúrgicos y tijeras.
- Separe el tejido subcutáneo y la fascia, limpie el cráneo del cráneo con algodón seco estéril para detener el sangrado y marque el bregma con un rotulador.
- Refiérase al Mapa Estereotáxico del Cerebro de Rata considerando el bregma como punto de origen, marque los tres puntos, el núcleo talámico anterodorsal (ad) (posterior (P): 2,0 mm al bregma; lateral (L): 1,4 mm a la línea media) para inyectar el factor de crecimiento transformante humano recombinante-β1 (RHTGF-β1) y fijar un tornillo, el área del ventrículo lateral (VI) (posterior (P): 0,8 mm hasta el bregma; lateral (L): 2,0 mm hasta la línea media) para inyectar la proteína beta amiloide 25-35 (Aβ25-35) y tricloruro de aluminio (AlCl3), y el segundo lugar de fijación del tornillo (Frontal (F): 2,0 mm hasta la bregma; lateral (L): 1,5 mm hasta la línea media).
- Taladre suavemente tres orificios de 1 mm de diámetro con un taladro de hueso flexible designado en los tres puntos anteriores del cráneo (paso de 1,5). No atornille más de lo necesario para evitar apuñalar el tejido cerebral.
- Detenga el sangrado y limpie la superficie del cráneo repetidamente con algodón seco estéril.
- Inserte una aguja conectada a la bomba de microinyección en el cerebro a 4,6 mm de profundidad e inyecte suavemente 1 μL de RHTGF-β1 (10 ng) en el área de anuncios. Mantenga la aguja durante 2 minutos después de la inyección y extraiga lentamente la aguja.
- Fije los dos tornillos en la calavera, designados en los puntos del anuncio, y el segundo lugar de fijación del tornillo de la calavera (que se designó en el paso de 1,5) con un destornillador pequeño. No atornille más de lo necesario para evitar apuñalar el tejido cerebral.
- Ensamble el sistema de implantación de cánulas e inserte la cánula ficticia en la cánula guía después de la desinfección a alta presión.
- Inserte la cánula guía de tubo de acero inoxidable en el cerebro a 4,6 mm en el área del VI a través del orificio del cráneo con la ayuda del soporte de la cánula del aparato estereotáxico de las ratas.
- Mezcle el material de la base de la dentadura postiza con agua de la base de la dentadura postiza en una proporción de 1,5 g por 1 mL, coloque la pasta para cubrir el pedestal de plástico de la cánula guía y dos tornillos para inmovilizar la cánula guía y cubrir toda la incisión de la piel para evitar infecciones de la piel.
- El día 2 de la operación, las ratas fueron anestesiadas con inhalación de isoflurano utilizando la máquina de anestesia para animales pequeños. Extraiga la cánula fictaña, inserte la cánula interna en la cánula guía y atornille el tornillo de fijación para inmovilizar la cánula interna.
- Ajuste el tubo de polietileno que conecta la bomba de microinyección a la cánula interna y regule la velocidad de inyección a 1 μL/min. Microinyecte el Aβ25-35 o AlCl3 en el VI.
- Microinyecte 4 μg (1 μL) de Aβ25-35 diariamente durante 14 días por la mañana y 3 μL de AlCl3 (1%) diariamente durante 5 días por la tarde bajo anestesia con isoflurano.
- Espere 5 minutos después de finalizar la inyección, extraiga suavemente la cánula interna y vuelva a insertar la cánula ficticia en la cánula guía.
- El día 15, después de la cirugía (que corresponde al último día de inyección de Aβ25-35), desmontar el sistema de implantación de la cánula. Retire suavemente el material base de la dentadura postiza con tijeras quirúrgicas y pinzas, desatornille los dos tornillos, extraiga la cánula guía y desinfecte la herida con betadine. Rellena el orificio del cráneo con cemento óseo y sutura la piel con un método simple de sutura interrumpida.
- Realice la misma operación con el grupo operado simulado y microinyecte solución salina DMSO al 0,1%.
