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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Abrasión de la almohadilla del pie del ratón
- Anestesiar a un ratón C57BL/6 (5-7 semanas de edad) con anestésico de gas isoflurano, administrado a una dosis del 3% a través de un pequeño sistema de anestesia (cámara).
- Coloque el ratón en el plano quirúrgico de la anestesia en su espalda, antes de la inoculación, en la almohadilla de la pata trasera. Coloque un cono de nariz con un diafragma (una hendidura del tamaño suficiente para que quepa en el hocico del animal) al ratón y administre anestésico con gas isoflurano a una dosis constante de 1,5 % a 2,0 %.
- Vigile de cerca al ratón para ver si responde a un estímulo doloroso creado por el pellizco fuerte del dedo del pie con fórceps.
- Agarre ligeramente una almohadilla trasera con pinzas planas.
- Desgasta suavemente la piel glabra de la almohadilla trasera aproximadamente 20 veces, entre el talón y las almohadillas para caminar, con una lima (grano 100-180). No induzca el sangrado abrasando con demasiada frecuencia o aplicando demasiada presión.
- Con pinzas finas, retire lentamente el estrato córneo desprendido por abrasión para exponer el estrato basal.
>2. Inoculación de almohadillas PRV
- Prepare el inóculo del virus diluido hasta el título deseado en medios DMEM que contengan un 2% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina (Tabla de materiales).
- Cuantificar el número de unidades formadoras de placas (PFU) en el stock de virus en las células PK15 para calcular y estandarizar la dosis viral y diluir el inóculo viral en consecuencia.
nota: En este estudio, se utilizó una cepa virulenta de PRV (PRVBecker) a una dosis de 8 x 106 PFU. Esta dosis se optimizó en un experimento preliminar previo para garantizar que todos los animales inoculados mostraran síntomas clínicos a las 82 h después de la inoculación (HPI).
- Mantenga el inóculo del virus en hielo y mezcle suavemente antes de usar.
- Añada una gota de 20 μL de inóculo viral (8 x 106 UFP) sobre la almohadilla desgastada (administración tópica). Realizar simulacros de inoculación (solo medio) en paralelo.
- Frote suavemente 10 veces con el eje de una aguja para facilitar la adsorción del virus. Evite rascarse con la punta de la aguja. Repite este paso cada 10 min.
- Mantenga el ratón bajo anestesia durante 30 minutos hasta que la almohadilla desgastada esté seca.
- Después de suspender la anestesia, controle al ratón hasta que pueda mantener la decúbito esternal y colóquelo en una jaula individual para el seguimiento clínico y la toma de muestras.