Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
C57BL/6 (H-2b) ratones hembra, de 8 semanas de edad, fueron comprados y los ratones C57BL/6 AQP4-/- fueron proporcionados por A. Verkman.
1. Inmunización de ratones con péptidos AQP4
- Prepare el material de trabajo completo del adyuvante de Freund (CFA).
- Moler finamente una preparación disecada de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) con un mortero.
- Agregue H37Ra molido al adyuvante de Freund incompleto hasta una concentración final de 4 mg/mL. El CFA puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
- Disuelva el péptido AQP4 del antígeno liofilizado (Ag) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración final de 1 mg/mL. Mantener a 4 °C o con hielo.
- Prepare el conjunto de 2 jeringas luer-lock, unidas con una llave de paso, que contienen la emulsión CFA/péptido.
- Conecte una jeringa luer-lock de vidrio sin émbolo a una llave de paso de nailon de 3 vías con 2 conexiones luer-lock macho. Cierre la llave de paso desplazando la palanca hacia la jeringa. Coloque el extremo abierto de la jeringa hacia arriba, permitiendo que la jeringa actúe como un tubo de ensayo. Colóquelo en una rejilla de tubos para mayor estabilidad.
- Vortex, el material de trabajo CFA y la solución Ag. Agregue un volumen 1:1 de péptido / CFA a la jeringa abierta. Se requieren 200 μL de CFA/Ag (4 x 50 μL) por ratón.
nota: Por lo general, se pierde aproximadamente 1 ml de preparación en la llave de paso, lo que reducirá la cantidad disponible para la inmunización. Por lo tanto, es importante incorporar esto en el cálculo del volumen total requerido.
Ejemplo: Para la inmunización de 5 ratones: (200 μL/animal x 5 animales) + 1 mL de volumen adicional = 2 mL de CFA/Ag total requeridos.
- Inserte el émbolo de vidrio en la jeringa y, mientras lo mantiene en su lugar, invierta la jeringa para que la llave de paso quede orientada hacia arriba. Cambie la palanca de la llave de paso a la conexión hembra no utilizada. Aplique presión con cuidado al émbolo de vidrio para eliminar el exceso de aire de la jeringa. El líquido llena la segunda conexión luer-lock macho de la llave de paso.
- Conecte una segunda jeringa de vidrio (émbolo completamente insertado) a la segunda conexión luer-lock macho de la llave de paso. Este debe ser un sistema cerrado de 2 jeringas de vidrio conectadas con una llave de paso que contenga la menor cantidad posible de exceso de aire.
- Para crear una emulsión, mezcle empujando los émbolos para que el líquido pase alternativamente entre las 2 jeringas durante unos 2 minutos. Enfríe las jeringas en hielo durante unos 10 minutos. Repita el enfriamiento y la mezcla hasta que haya un cambio claro en la viscosidad de la preparación, lo que da como resultado una emulsión blanca muy rígida. Refrigere las jeringas que contienen la emulsión a 4 °C o manténgalas en hielo.
- Transfiera toda la emulsión a una jeringa luer-lock de vidrio, retire la jeringa de vidrio vacía y reemplácela con una jeringa luer-lock de 1 ml para inyección. Llene la nueva jeringa con emulsión, retírela de la llave de paso y coloque una aguja (25G x 5/8).
- "Pruebe con agua" la emulsión para ver si tiene consistencia. Expulsa una gota de la emulsión en un plato pequeño con agua. La emulsión no debe dispersarse, lo que indica que es apta para la inyección.
- Si la emulsión se dispersa, no está lista para la inyección; transfiera el líquido de nuevo a las jeringas de vidrio y continúe mezclando y luego enfríe nuevamente hasta que la emulsión esté rígida.
- Vuelva a probar la emulsión hasta que se haya logrado la consistencia adecuada.
- Inyecte al ratón donante AQP4-/- por vía subcutánea (s.c.) una emulsión que contenga el péptido AQP4. Cada ratón recibe 4 inyecciones de 50 μL de s.c. (200 μL en total (100 μg de péptido)). Los 4 sitios incluyen ambos lados de la parte inferior del abdomen, que drenan hacia los ganglios linfáticos inguinales (LN), y ambos lados de la pared torácica medial a cada axila, que drenan hacia la LN axilar. La transferencia adoptiva requerirá 1-2 ratones donantes inmunizados por ratón receptor.
>2. Cultivo de células T y polarización de células T proinflamatorias
- 10-12 días después de la inmunización, recoja LN de los ratones.
- En una bandeja de hielo, prepare placas de Petri de 60 mm equipadas con un filtro de células (tamaño de malla de 70 μm) y que contengan medios refrigerados del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor y 100 U/mL de penicilina-100 μg/mL de estreptomicina (pen-strep) (RFPS).
- Eutanasia de ratones mediante exposición al CO2, seguida de luxación cervical. Sumerja a los ratones en etanol al 70% y luego sujete cada almohadilla para los pies a una tabla de disección.
- Haz una incisión en la piel de la línea media desde la ingle hasta el cuello y baja por cada pierna. Retira la piel del peritoneo y sujétala con alfileres a la tabla. Diseccione la LN inguinal y axilar y colóquela en la placa de Petri que contiene RFPS, en hielo.
- Para los experimentos de transferencia adoptiva, se deben combinar las LN de todos los animales del mismo grupo de inmunización. Para los análisis de citometría de flujo del uso de Vβ, separe el LN de los animales individuales.
- Coloque el filtro de celdas que contiene el LN en un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga RFPS. Utilice el extremo plano de un émbolo de jeringa estéril de 5 mL para presionar las células LN a través del colador, lavando con 20-30 mL de RFPS para facilitar la recuperación de las células. Mantenga las células LN en hielo durante todo el procesamiento hasta el momento del cultivo.
- Lavar dos veces, centrifugando a 393 x g durante 5 min. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las células LN en medios de células T (TCM). TCM contiene RPMI con 10% de FBS inactivado por calor, 292 μg/mL de L-glutamina, 110 μg/mL de piruvato de sodio y 55 μM de 2-mercaptoetanol y pen-estreptococo. Normalmente, se utiliza un volumen de 5 mL TCM por ratón donante.
- Cuente las celdas LN. El rendimiento esperado es de aproximadamente 3-6 x 107 células LN por donante de ratón inmunizado.
- Establecer culturas polarizadas para la transferencia adoptiva.
- Prepare un cultivo polarizador Th17 de 5 x 106 células LN por mL con 10 μg/mL de Ag, 20 ng/mL de interleucina (IL)-23 recombinante de ratón y 10 ng/mL de IL-6 recombinante de ratón en MTC.
- Alternativamente, para la polarización Th1, prepare un cultivo de 5 x 106 células LN por mL con 10 μg/mL de Ag y 10 ng/mL de IL-12 recombinante de ratón en TCM.
- Agregue 2 mL (1 x 107 células) por pocillo de la mezcla de cultivo polarizante en una placa de 12 pocillos. Las células LN de 2-4 ratones donantes llenarán una placa de 12 pocillos. Mantener los cultivos en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante 72 h.
- Comprobar visualmente la activación de las células LN en cultivo a las 48 h y a las 72 h. Las células activadas formarán grupos extensos y las células T aumentarán de tamaño, volviéndose más pleomórficas. El aumento del metabolismo provocará una disminución del pH en el medio, cambiando de melocotón a naranja. Si el pH es lo suficientemente bajo como para que el medio se vuelva amarillo, agregue 1 mL de MTC fresco para evitar la toxicidad de las células en las 24 horas restantes.
- Proceder a la transferencia adoptiva.
>3. Transferencia adoptiva de células T patógenas específicas de AQP4
NOTA: Este paso se deriva de la Sección 2.5: Cultivo de células T y polarización proinflamatoria de células T.
- Recupere las células polarizadas de placas de 12 pocillos pipeteando hacia arriba y hacia abajo para desalojarlas y transfiriéndolas a un tubo de 50 ml. Mantener en hielo hasta las inyecciones.
- Cuente las células, lávelas dos veces en PBS frío y prepare una suspensión de 1 x 108 células/mL en PBS. Por lo general, inyecte las células en una hora.
- Mezcle suavemente las células girándolas y transfiéralas a una jeringa de 1 ml en el momento de la inyección. Administrar 200 μL de las células (2 x 107) por vía intravenosa (i.v.) a cada ratón, a través de la vena de la cola.
- Inyecte a cada ratón receptor i.p. 200 ng de toxina B. pertussis diluida en 200 μL de PBS ese día y 2 días después. Monitoree a los ratones diariamente para detectar signos de enfermedad clínica.
