Tinción inmunofluorescente de poblaciones neuronales en el tracto gastrointestinal murino embrionario

Resumen

Fuente: Barlow-Anacker, A. J., et al., Inmunotinción para visualizar el desarrollo del sistema nervioso entérico murino. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra la inmunotinción del tracto gastrointestinal murino embrionario para visualizar y analizar la distribución de la población neuronal utilizando inmunofluorescencia y microscopía confocal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Protocolo de inmunotinción

1. Si las muestras se han almacenado en sacarosa al 30%, enjuáguelas 3 veces durante 20 minutos en 1x PBS sobre una plataforma mecedora.
2. Coloque los tractos gastrointestinales en la solución de bloqueo en una plataforma oscilante durante 1 hora en RT.
3. Retirar la solución de bloqueo e incubar los tractos gastrointestinales con la cantidad adecuada de anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo durante 4 horas a RT o O/N a 4 °C en una plataforma oscilante. Utilice una dilución 1:1.000 del anticuerpo anti-Hu humano (suero obtenido del paciente), una dilución 1:1.000 del anticuerpo anti-proteína fluorescente verde (GFP) de pollo y una dilución 1:100 del anticuerpo anti-ChAT de cabra.
   nota: Utilizamos un anticuerpo humano anti-Hu que se obtuvo localmente de un paciente; sin embargo, los anticuerpos anti-Hu están disponibles comercialmente, por ejemplo, anti-Hu de ratón (uso en dilución 1:500).
4. Enjuague los tractos gastrointestinales en 1x PBS 3 veces durante 5 minutos y luego durante 1 hora en RT sobre una plataforma mecedora.
5. Reemplace el 1x PBS con anticuerpos secundarios diluidos 1:500 en solución de bloqueo en una plataforma oscilante durante 4 horas a RT o O/N a 4 °C. Use colorante anti-amina reactiva para burros como Dylight, burro anti-pollo Cy2 y burro anti-cabra Cy5. Si usa el anticuerpo anti-Hu de ratón, use una dilución 1:500 de colorante reactivo a amina anti-ratón de burro 405.
   nota: La intensidad de la expresión endógena de GFP y tdTomato y la claridad de la inmunotinción aumentan con la edad de desarrollo. Por lo general, inmunoteñimos los intestinos embrionarios individualmente en tubos de 0,2 ml con 150 μl de solución de tinción para reducir el volumen de anticuerpos utilizados y también para garantizar una tinción eficiente del tejido.
6. Enjuague los tractos gastrointestinales en 1x PBS 3 veces durante 5 minutos y luego durante 1 hora en RT sobre una plataforma mecedora.
7. Coloque unas gotas de medio de montaje de fluorescencia con DAPI en un portaobjetos de vidrio. Sumerja el tracto gastrointestinal en el medio de montaje de fluorescencia y agregue un cubreobjetos directamente sobre el tejido. El medio de montaje de fluorescencia -G es un compuesto soluble en agua que proporciona un sellado semipermanente.
   nota: Utilice un medio de montaje de fluorescencia como Vectashield, un medio de montaje a base de glicerol que evita el desvanecimiento de los anticuerpos y el fotoblanqueo. Ambos productos permiten almacenar los tejidos durante largos períodos de tiempo a 4 °C.
8. Capture imágenes de cada fluoróforo utilizando un microscopio confocal. Utilice las longitudes de onda de excitación para fluoróforos y filtros empleadas en la Tabla 1.
9. Realice análisis de imágenes asistido por ordenador utilizando el software adecuado en función del tipo de confocal utilizado para capturar imágenes.

Tabla 1: Longitudes de onda de excitación de imágenes confocal, fluoróforos y filtros. Se presentan las longitudes de onda de excitación, los fluoróforos detectables y los filtros empleados. Esta información se puede utilizar para elegir combinaciones de anticuerpos secundarios para la inmunofluorescencia multicolor.

Excitación			Emisión
Línea Láser	Tipo de fluoróforo	Ejemplos	Tubo fotomultiplicador	Opciones de filtro
408 nm	azul	Alexa Fluor 405, Cascade Blue, Coumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, la mayoría de los puntos cuánticos	1	BP 425-475 nm
488 nm	verde	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calceína, Cy2, eGFP, FITC, Verde Oregón, YO-PRO-1	número arábigo	BP 500-550 nm
561 nm	rojo	Alexa Fluor 546, 555, 568 y 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Ficoeritrina (PE), Propidium Yodo (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	BP 570-620 nm
638 nm	Rojo lejano	Alexa Fluor 633 y 647, aloficocianina (APC), Cy5, TO-PRO-3	4	BP 663-738 nm

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina tamponada con fosfato	Oxoide	BR0014G
Albúmina sérica bovina	pescador	BP1605
Tritón X-100	sigma	X100
Osciloscopio de fluorescencia	Nikon	Estereoscopio SMZ-18
Tubos Eppendorf de 1,5 ml	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
Portaobjetos de vidrio	pescador	Teléfono 12-550-15
Cubreobjetos	VWR	16004-330
Microscopio confocal	Nikon	Nikon A1
Elementos de Nikon	Nikon