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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Modelo animal
- Cruza ratones hemicigotos Tg(Gfap-luc+/-) (ratones transgénicos que expresan luciferasa de luciérnaga de fuego) con ratones hemicigotos Tg(M83+/-) (ratones transgénicos que expresan alfa-sinucleína humana con la mutación familiar A53T) para generar ratones hemicigotos Bg(M83+/-:Gfap-luc+/-).
- Genotipar la progenie con reacción en cadena de poliemerasa (PCR) en tiempo real para detectar la presencia del transgén que codifica para la alfa-sinucleína humana y con PCR estándar para luciferasa de luciérnaga.
- Inocular a los animales a la edad de seis a ocho semanas.
>2. Preparación del inóculo
- Prepare alfa-sinucleína humana recombinante monomérica con la mutación A53T en un tampón de solución salina tamponada (TBS) que contiene 150 mM de NaCl en 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2).
- Preparar la alfa-sinucleína fibrilar para las inoculaciones agitando 3 μg/μL de alfa-sinucleína humana monomérica recombinante en un agitador orbital a 800 rpm y 37 °C durante 5 días.
- Diluir ensamblajes de fibrillas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta alcanzar una concentración final de 1 μg/μL para inoculaciones intraperitoneales.
- Fragmente las fibrillas de alfa-sinucleína con un sonicador de varillas durante 1 minuto (40 pulsos de 0,5 s de duración con una pausa de un segundo entre cada pulso y una amplitud ajustada al 50%) en hielo. Para evitar la contaminación por siembra cruzada, utilice sondas de sonicación limpias para preparar diferentes inóculos.
>3. Inyecciones intraperitoneales
- En el caso de las inyecciones intraperitoneales, narcotizar brevemente a los animales en una cámara de anestesia por inhalación con isoflurano/oxígeno utilizando un caudal de 2 L/min y el vaporizador ajustado al 2%. Pellizque el dedo del pie del animal y confirme que no retire su extremidad trasera para asegurar una anestesia adecuada.
- Llene una jeringa hipodérmica desechable de 27 G con 50 μL de fibrillas de alfa-sinucleína sonicadas o PBS.
- Inyectar directamente en el peritoneo del ratón y evitar penetrar en el intestino delgado o ciego situado detrás de la pared abdominal sujetando al animal en posición dorsal con la cabeza hacia afuera del investigador y hacia abajo a unos 45°. Monitoree a los animales hasta que se hayan recuperado de la anestesia.