1. Monitoreo de la propagación transcelular de proteínas similares a priones mediante imágenes de lapso de tiempo in vivo
NOTA: Cultive líneas de tipo silvestre (WT) (N2) y transgénicas de C. elegans de acuerdo con los métodos estándar y controle cuidadosamente la temperatura de cultivo.
- Generar líneas transgénicas de C. elegans que expresen la proteína similar a un prión, marcadas con una proteína fluorescente roja monomérica (mRFP).
- Preparar poblaciones sincronizadas por puesta de huevos o blanqueo de acuerdo con métodos estándar.
- Sincronización por puesta de huevos
- Transfiera de 10 a 20 adultos grávidos en un plato y déjelos poner huevos durante 1 a 2 horas. Retire a los adultos del plato y deje que la progenie crezca hasta la edad deseada.
- Sincronización por blanqueo
- Recoja una población no sincronizada de adultos grávidos y blanquee con una solución alcalina de hipoclorito (250 mM de hidróxido de sodio (NaOH) y dilución 1:4 (v/v) de lejía comercial en agua (H2O)). Lavar los huevos dos veces (218 x g durante 1 min) con tampón M9 (21 mM Na, 2HPO,4·7H,2O (hidrogenofosfato disódico, heptahidratado), 22 mM (dihidrogenofosfato potásico), KH2PO4, 86 mM cloruro sódico (NaCl), 1 mM MgSO,4·7H,2O (sulfato de magnesio heptahidratado), añadirdH2O hasta 1 L).
- Permita que eclosionen en el tampón M9 con una agitación suave durante la noche (O/N) a 20 °C. El desarrollo de los gusanos se detendrá en la etapa L1 en ausencia de una fuente de alimento, dejando una población sincronizada. Transfiera las L1 a placas frescas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con la bacteria OP50 E. coli y deje que la progenie se desarrolle hasta la edad deseada.
- Prepare almohadillas de agarosa al 2% (en H2O) en un portaobjetos de microscopio como se describe.
- Prepare dos portaobjetos de microscopio con cinta adhesiva colocada en toda su longitud para utilizarlos como espaciadores. Coloque un tercer portaobjetos de microscopio entre ellos.
- Disolver la agarosa al 2% en H2O y pipetear una gota en el portaobjetos limpio.
- Coloque un cuarto portaobjetos perpendicular a los otros tres portaobjetos encima de la gota de agar. Presiónelo suavemente hacia abajo para aplanar la almohadilla hasta que tenga el mismo grosor que la cinta de etiquetado.
- Déjalo secar durante 1 minuto antes de quitar los espaciadores y separar suavemente los portaobjetos. La almohadilla de agar se pegará a uno de ellos.
- Pipetee ~10 μl de anestésico (2 mM de levamisol en tampón M9) en la almohadilla y transfiera ~10 animales con una púa de alambre de platino. Cubra con un cubreobjetos (~22 x 22 mm) y tome imágenes dentro de 1 hora.
- Alternativamente, para adquirir películas durante un período de tiempo más largo o para reducir aún más la posibilidad de cualquier movimiento de los animales, use una combinación de anestésico e inmovilización con perlas.
- Prepare almohadillas de agarosa al 10% (en tampón M9) como se describe y agregue gusanos a la solución estándar de tamaño de nanoesfera de 3 μl (perlas de poliestireno, 100 nm) más 3 μl de anestésico (4 mM de levamisol en tampón M9). Cubra suavemente con un cubreobjetos. Para evitar la desecación, selle el cubreobjetos con VALAP (una mezcla de cantidades iguales de vaselina, lanolina y cera de parafina).
- Imagen de gusanos inmovilizados utilizando un microscopio confocal.
NOTA: Los resultados se obtienen utilizando un microscopio confocal AF de disco giratorio equipado con una cámara EM-CCD y un software de análisis de imágenes y automatización de microscopía como MetaMorph que describe los detalles a continuación, pero también se pueden utilizar otros sistemas de imágenes confocales comparables.
- Utilice el objetivo de aceite 63X o 100X/1.4NA y coloque el portaobjetos del microscopio que contiene gusanos en el soporte del portaobjetos del microscopio.
- Abra el software. Ajuste la potencia del láser y los filtros para la obtención de imágenes mRFP. Utilice el láser de 561 nm al 10% de potencia y el filtro de emisiones >600 nm.
- Abra "Adquisición multidimensional". En la pestaña "Principal", marque las casillas "Timelapse" y "Run Journals" (Enfoque automático de hardware: desactivado).
- En la pestaña "Guardar", seleccione o cree la carpeta del directorio donde se deben guardar los archivos. Asigne un nombre al archivo.
- En la pestaña "Longitud de onda", seleccione la iluminación adecuada y ajuste la exposición y la ganancia. Utilice "YokoQuad Red" (o una configuración de iluminación equivalente para imágenes mRFP) con una exposición entre 100 y 300 mseg y una ganancia de cámara entre 100 y 300, dependiendo de la muestra individual (evaluada mediante el uso de la imagen en vivo).
- En la pestaña "Timelapse", seleccione "Número de puntos de tiempo" = 301, "Duración" = 5 min y "Tiempo/Intervalo" = 1 seg.
- En la pestaña "Diarios", seleccione Diario: "AFC SET Z HOLD" y "AFC Return to Z HOLD", Tipo: "Especial" (dos veces), Punto inicial: "Punto de inicio del tiempo" y "Punto de fin del tiempo". Esta opción de enfoque automático es importante para obtener imágenes de la misma sección durante un período de tiempo más largo.
- Cuando se complete la configuración, presione "Adquirir". El video de lapso de tiempo se guarda como archivos TIFF separados.
