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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Producción y purificación de virus adenoasociados recombinantes (rAAV)
>Nota: la producción y purificación del vector rAAV fue realizada por el Núcleo de Vectores Virales de Lovaina (LVVC).
- En resumen, transfecte células HEK 293T adherentes de paso subconfluente (<50) utilizando una solución de transfección de NaCl de polietileno lineal de 25 kD y 150 nM y tres plásmidos diferentes en una proporción de 1:1:1 en suero bovino fetal al 2% en medio DMEM. Después de 24 horas de incubación a 37 °C en un 5% de CO2, reemplace el medio con suero fetal bovino fresco DMEM medio 2%.
nota: Los plásmidos incluyen las construcciones para el serotipo AAV7, el plásmido de transferencia AAV que codifica la alfa-sinucleína (α-SYN) mutante A53T humana bajo el control del promotor de sinapsina1 mejorado CMVie, y el plásmido auxiliar adenoviral pAdvDeltaF6.
- Coseche el medio 5 días después de la transfección transitoria y concéltelo mediante filtración de flujo tangencial.
- Purifique las partículas vectoriales rAAV del medio concentrado utilizando un gradiente escalonado de yodixanol.
- Utilice técnicas estándar de PCR en tiempo real para la determinación de copias genómicas (GC). En este protocolo, se utilizó un título vectorial de 3,0 E11 GC/ml para desarrollar un modelo de rata basado en α-SYN para la enfermedad de Parkinson (EP).
2. Inyección estereotáctica del vector rAAV α-SYN en la sustancia negra (SN) de la rata (Figura 1)
- Aloje ratas Wistar hembras de ocho semanas de edad que pesen entre 200 y 250 g en un ciclo normal de luz/oscuridad de 12 horas con libre acceso a alimentos granulados y agua del grifo.
- Someter a la rata a anestesia intraperitoneal (i.p.) que contenga una mezcla de ketamina (60 mg/kg) y medetomidina (0,4 mg/kg). Una vez que la rata esté anestesiada y no reaccione al apretar las diferentes patas, administre un microtranspondedor por vía subcutánea en la espalda de la rata para su posterior reconocimiento utilizando un implante de microtranspondedor. Compruebe si el microtranspondedor está colocado correctamente y puede ser leído por el dispositivo de lectura.
- Corta el cabello en la parte superior del cuero cabelludo. Aplique un anestésico local tanto en el cuero cabelludo como en las orejas. Realizar el resto del procedimiento quirúrgico bajo flujo laminar mediante técnicas asépticas.
- Coloque a las ratas en un marco estereotáctico de la cabeza usando dos barras para los oídos, una boca y una barra para la nariz. Cubre el cuerpo de la rata con una manta de papel para evitar que baje la temperatura corporal. Aplícate un lubricante ocular para evitar que los ojos se sequen.
- Desinfectar el cuero cabelludo con jodium 1% en isopropanol 70% y hacer una pequeña incisión en la línea media del cuero cabelludo. Raspe suavemente las membranas del cráneo y enjuague con solución salina. Deja que el cráneo se seque durante varios minutos. Observar las suturas craneales y los dos puntos de referencia: Bregma y Lambda.
- Para inyectar el vector rAAV en el SN, defina las coordenadas hacia Bregma (anteroposterior: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm; y dorsoventral: 7,2 mm calculado a partir de la duramadre)
nota: Las coordenadas tridimensionales para cada región de interés se pueden calcular utilizando un atlas estereotáxico del cerebro de rata, utilizando Bregma como punto de referencia anatómico.
- Llene una jeringa de microinyección de 10 μl (calibre 30 de 20 mm) con el vector rAAV y colóquela en el instrumento estereotáxico conectado a una bomba de microinyección motorizada. Controle el volumen liberando una gota de vector y elimine en un detergente de limpieza polivalente pH 9 (por ejemplo, RBS).
- Compruebe visualmente si la cabeza está fijada recta en el marco de la cabeza y evalúe el eje izquierda-derecha. Defina visualmente cuidadosamente las coordenadas anteroposterior y mediolateral para Bregma y Lambda y mida su altura con una aguja de calibre 30 de 20 mm en el brazo dorsoventral del marco estereotáctico.
- Permita un máximo de 0,3 mm de diferencia de altura entre Bregma y Lambda. Vuelva a colocar la aguja en Bregma y aplique las coordenadas anteroposterior y mediolateral moviendo el brazo anteroposterior y el brazo mediolateral del marco estereotáctico.
- En el lugar de la inyección, mida la altura del cráneo y asegúrese de que no difiera más de 0,3 mm de la altura de Bregma. Perfora un agujero en el cráneo con un diámetro de aproximadamente 2 mm. Mide la altura de la duramadre, que te servirá de referencia para aplicar la coordenada dorsoventral. Alternativamente, reste un grosor fijo para el cráneo (0,9 mm).
- Penetra en la duramadre con una aguja de calibre 26 y absorbe la sangre con tejido estéril. Espere hasta que todo el sangrado se haya detenido antes de continuar.
- Inserte lentamente la jeringa de microinyección de 10 μl precargada con solución vectorial en el cerebro hasta la profundidad predeterminada (coordenada dorsoventral). Espere 1 minuto con la aguja en su lugar. Inyecte 3 μl de solución vectorial (3,0 copias del genoma E11/ml (dosis vectorial media) o 1,0 E12 GC/ml (dosis vectorial alta) de vector rAAV2/7 α-SYN o vector de control eGFP) utilizando la bomba de microinyección motorizada con un rendimiento de 0,25 μl/min.
- Después de la inyección, mantenga la aguja en su lugar durante otros 5 minutos antes de retirarla lentamente. Coser el cuero cabelludo con poliéster trenzado 3.0 recubierto, desinfectar con 1% de jodio en 70% de isopropanol y retirar suavemente al animal del instrumento estereotáctico. Primero afloje la nariz y la barra bucal, luego las dos barras de los oídos.
- Para revertir la anestesia, inyecte a la rata por vía intraperitoneal 0,5 mg/kg de atipamezol y coloque a la rata en una jaula limpia sobre una placa calefactora de 38 °C hasta que se despierte. Cubre a la rata con una manta de papel para evitar que baje la temperatura corporal.
- Proporcione un fácil acceso a los alimentos y al agua durante las primeras horas. Vigila a la rata durante los primeros días. Si es necesario, aplique analgesia.
nota: No es necesario quitar los puntos del cráneo. Después de 1-2 semanas, el cráneo está completamente reparado y los puntos se aflojan.
