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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Homogeneización y fraccionamiento
- Selección de tejidos
NOTA: Se seleccionó tejido de corteza frontal postmortem congelado de control sano (Ctl) y casos de EA confirmados patológicamente (n = 2). La evaluación neuropatológica post-mortem de la distribución de la placa amiloide se realizó de acuerdo con los criterios de puntuación semicuantitativos del Consorcio para Establecer un Registro de la Enfermedad de Alzheimer, aunque la patología de los ovillos neurofibrilares se evaluó de acuerdo con el sistema de estadificación Braak.
- Obtener tejido cerebral postmortem congelado de casos de control sano (Ctl) y casos de EA confirmados patológicamente. Utilizando recipientes de hielo seco, pinzas y una hoja de afeitar, extraiga porciones de ~ 250 mg de materia gris de cada muestra de tejido en botes de pesaje desechables tarados, teniendo cuidado de evitar que el tejido se descongele. Registre el peso de cada pieza a homogeneizar.
- Realice un impuesto especial ~ 250 mg de materia gris con pinzas y navaja de afeitar mediante inspección visual para localizar la interfaz entre la materia gris exterior y la materia blanca interior. Evite la materia blanca y, lo que es más importante, los vasos sanguíneos grandes o las regiones sanguinolentas, las meninges o la aracnoidea. Mantenga el tejido congelado durante el proceso de corte trabajando rápida y frecuentemente colocando el bote de pesaje con tejido cerebral en recipientes de poliestireno con hielo seco.
- Registre el peso exacto de la materia gris extirpada de cada pieza congelada utilizando una balanza analítica. Calcule el volumen de tampón bajo en sal (LS) (ver Tabla 1) necesario para la homogeneización del rebote (5 mL/g o 20% p/v).
- Prepare 10 ml de tampón LS con 1x cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa y enfríe con hielo.
- Retire el pañuelo pesado y el bote de pesaje del hielo seco y córtelo en trozos de aproximadamente 2 x 2 mm a medida que se descongela. Transfiera a un tubo homogeneizador de onzas preenfriado de 2 mL con hielo.
- Agregue 5 mL/g (20% p/v) de tampón helado bajo en sal (LS) con un cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa 1X.
- Homogeneizar el tejido cerebral en hielo utilizando aproximadamente 10 golpes de mortero de alto despeje A y 15 golpes de mortero de baja holgura B.
- Transfiera todo el homogeneizado a un tubo de polipropileno de 2 ml con una pipeta Pasteur de vidrio. Etiquete el tubo con "TH" (homogeneizado total), el número de caso de tejido y el volumen del homogeneizado. Alícuota 0,8 mL en un tubo de 1,5 mL marcado. Cualquier exceso de homogeneizado puede alícuota similar y almacenarse a -80 °C.
- A cada alícuota de 0,8 mL, añadir 100 μL de NaCl 5 M y 10% (p/v) de sarkosil a concentraciones de 0,5 M y 1% p/v, respectivamente. Mezclar bien los tubos por inversión e incubar en hielo durante 15 min. Etiquete los tubos con "TH-S" (Total Homogeneate-Sarkosyl) para indicar que los homogeneizados están en tampón de sarkosyl (Tabla 1).
- Sonicar cada tubo durante tres pulsos de 5 s al 30% de amplitud en hielo (intensidad máxima = 40%) utilizando una sonda de micropunta.
- Determine las concentraciones de proteínas de los homogeneizados utilizando el método de ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
nota: La concentración media de proteínas de homogeneizados de TH-S preparados a 5 mL LS por gramo de tejido es de 15-20 mg/mL. Los homogeneizados pueden fraccionarse inmediatamente o almacenarse a -80 °C hasta su uso.
- Diluir los homogeneizados de TH-S a 10 mg/mL utilizando tampón sark helado (Tabla 1) con inhibidores de proteasa y fosfatasa 1x.
- Transfiera 5 mg de proteína (0,5 ml) de cada homogeneizado de TH-S a tubos de ultracentrífuga de policarbonato de 500 μl y empareje el equilibrio con sark-buffer. Cargue los tubos en un rotor preenfriado y ultracentrífuga a 180.000 x g durante 30 min a 4 °C. Transfiera los sobrenadantes solubles en sarkosil (S1) a tubos de 1,5 mL y almacene a -80 °C.
NOTA: (Lavado opcional) Añada 200 μL de tampón Sark a los tubos de ultracentrífuga que contienen las fracciones insolubles en detergente (P1) y desaloje los gránulos (P1) del fondo de los tubos de ultracentrífuga con una punta de pipeta de 200 μL.
- Haga girar brevemente los tubos invertidos durante 2-3 s (≤2.500 x g) en una microcentrífuga para transferir los gránulos (P1) y el tampón a los tubos de 1,5 ml que se encuentran debajo. Vuelva a suspender los gránulos insolubles (P1) en el tampón Sark pipeteando hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que el gránulo se rompa.
- Equilibrado por pares y centrífuga a 180.000 x g durante 30 minutos adicionales a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante de lavado opcional (S2) e incube los gránulos insolubles en sarkosil (P2) en 50-75 μL de tampón de urea (Tabla 1) con 1x PIC (cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa) durante 30 min a temperatura ambiente para solubilizar el pellet.
nota: Caliente el tampón de urea a temperatura ambiente antes de usarlo para evitar la precipitación de SDS. Para aplicaciones sensibles al detergente, omita la SDS del tampón de urea y considere lavar el pellet insoluble (P2) en tampón con bajo contenido de sal antes de volver a suspenderlo en tampón de urea.
- Transfiera los gránulos resuspendidos (P2) a tubos de 0,5 ml y utilice una breve sonicación con micropuntas (1 s) al 20% de amplitud (intensidad máxima = 40%) para solubilizar completamente los gránulos.
- Determine las concentraciones de proteínas de las fracciones solubles en sarkosil (S1) e insolubles (P2) utilizando el método de ensayo BCA. Utilice estas fracciones inmediatamente o almacene a -80 °C hasta su uso.
Tabla 1: Lista de búferes
| Solución de sarkosil al 10% p/v: 10 g de sal sódica de N-lauril-sarcosina por 100 ml de ddH2O (agitar a RT durante la noche) |
| Tampón bajo en sal (LS): 50 mM HEPES pH 7.0, 250 mM sacarosa, 1 mM EDTA |
| Tampón Sarkosyl (sark): Tampón LS + 1% (p/v) de sarkosyl + 0,5 M de NaCl |
| Tampón de urea (almacenar a -20 °C): 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 8M urea, 2% SDS |